Protocol
1. Herstellung der Larven
- Um zu analysieren, eine gewünschte Larve zur Beförderung oder Wunschposition, wachsen Larven unter Standardbedingungen auf die gewünschte Alters mit Standard-fly Essen 11 bis 10 zu testen.
- Machen Sie eine Sieb-Filter durch Strecken Siebdruck Nylon-Mesh über einen Trichter. Sichern Sie die Mesh an der Trichterhals mit Gummiband. Setzen Sie den Trichter in ein Becherglas.
- Larven zur Analyse zu sammeln, Schaufel Spachtel-voller Lebensmittel, die Futtersuche Larven aus der Kulturflasche und wäscht mit RT Leitungswasser über die Mesh-Filter, das Sammeln einzelnen Larven direkt aus dem Netz mit einem Pinsel 10.
2. Herstellung von Teströhrchen
- Zur Vorbereitung auf die Teströhrchen stecken, vorsichtig kochen eine 4% Agar-Gel vermischen und in eine Petrischale bis zu einer Tiefe von 1,5 cm. Dadurch wird ein Stecker für jede Seite des Rohrs zu liefern, wenn Tier eingeschlossen ist. Die 4% ige Lösung ist ausreichend dicht, um Larven von p zu verhindernenetrating die Stecker.
- Stellen Sie sicher, dass Schläuche sauber und klar vor dem Einsetzen der Larven sind. Wenn sie nicht sind, kann diese Bewegungen aufgezeichnet blockieren.
- Um sicherzustellen, Larven genügend Feuchtigkeit für die Bewegung, bereiten Sie einen Squeeze-Flasche mit einer kleinen Menge an heißem Wasser. Kehren Sie die Flasche vorsichtig orientieren den Ausgang in Richtung einer Spüle und vorsichtig drücken, um Wasser aus dem Aufnahmeröhre zu vertreiben.
- Legen Sie die Flasche Auslass in die Teströhrchen. Drücken Sie die Flasche um Wasserdampf in die Teströhrchen zu liefern, bis eine dünne Schicht von Kondenswasser an der Wand der Röhre erscheint. Video 1 zeigt eine Larve bewegen in einer Röhre mit einer geeigneten Menge an Feuchtigkeit.
- Um die Larve in der Röhre abzudichten, entfernen die 1,5 cm dicke Agargel aus der Petrischale und legen über eine Netzoberfläche um den Luftstrom unter dem Agar zu ermöglichen, so dass ein Agar-Pfropfen in das Rohr eingeführt werden kann. Drücken eine Ende des Teströhrchen in das Gel zweimal zwei Steckern von Gel in ein Ende einzufügen.
- Mit einem paintbeilen, legen Sie eine Larve in das Rohr etwa 1,5 Zoll tief und verschließen den Schlauch durch Drücken der Ende nächsten Larve in das Agar-Gel. Der resultierende Druck wird von dem gegenüberliegenden Ende herauszudrücken des zweiten Plugs Agargel und Abdichtung des Tieres, das innerhalb der Röhre.
- Die Röhrchen in den MB5 Multi-Beam-Drosophila Activity Monitor (DAM) Gerät, und stellen Sie die Rohre Positionen, so dass die Tiere nicht über den Bereich der Sensoren bewegen.
- Um dieses Teströhrchen müssen beim Transport nicht aus der Infrarot-Leserahmen des Geräts schieben zu gewährleisten, halten Sie das Rohr an Ort und Stelle durch die Befestigung einen Ring von Kitt um jedes Rohr, wo es in Kontakt mit dem Aufnahmegerät.
3. Mess Aktivität
- Datensatz-Aktivität in einem Inkubator zu ungenauen Ablesungen aufgrund Schatten, Leuchtstoffröhren oder Temperaturschwankungen in dem Labor auftreten kann. Siehe Figur 5 für eine vorgeschlagene Anordnung des Systems.
- Stellen Sie einen Inkubator auf 20 ° C (siehe Abbildung 1). Um falsche Aufnahmen aufgrund von Störungen durch glühende Lichtquellen während der Aufnahme zu vermeiden, schalten Sie fluoreszierenden Inkubator Lichter und eine separate LED-Lichtquelle während der Aufnahme im Inkubator. Führen Sie eine Testversion ohne Tiere zu gewährleisten, dass Lichtverhältnisse nicht aberrant auslösen Sensoren. Es sollte keine aufgezeichneten Bewegungsdaten nach diesem Test.
- Erlauben Larven an die 20 ° C-Inkubator Einstellungen für 5 min vor der Test beginnen akklimatisieren.
- Um das DAM-System, um die gewünschte Aufzeichnungsintervalle (zB 1 min) eingestellt ist, sicherzustellen, DAM-System-Recording-Software heruntergeladen, um Rechner 12 und öffnen Sie die DAM-System-Datei, bevor Sie das Aufnahmekammer in die psiu Schnittstelle.
- Um den gewünschten Aufnahmefrequenz, bei der Daten gespeichert werden, wählen Sie Einstellungen fest und klicken Sie dann auf über oder unter dem Leseintervall Möglichkeit, verschiedenen Zeitrahmen zu wählen, in der Datengespeichert werden. Wählen Sie beispielsweise das Lesen Intervallzeiten von 1 s bis 1 h.
- In unterschiedlichem Parameter zur Aufzeichnung von Daten auszuwählen, wählen Sie Einstellungen und wählen Sie dann die entsprechenden Felder unter Ausgabedatentyp (zählt, bewegt, Positionen und zu wohnen, siehe Tabelle 1). Jeder Parameter bietet eine einzigartige Analyse der Larvenaktivität innerhalb der Röhre.
- Um die Aufnahme zu starten, schließen Sie den Monitor an die Stromversorgung Schnittstelleneinheit (psiu) mit CAB6 Telefonkabel. Schließen Sie das psiu an eine Steckdose an. Ein grünes Licht zeigt an, geeignete Verbindung.
- Schließen Sie das psiu durch ein Universal Serial Bus (USB) Kabel an einen Macintosh oder Windows-PC für die Datenaufzeichnung. Öffnen Sie das DAM SystemMB1v6x Programm auf dem Computer, um die Datenaufzeichnung automatisch gestartet.
- Nachdem der gewünschte Abholzeit ist, wählen Sie Beenden, und beenden Sie jetzt auf der DAM-Aktivität-Bildschirm; Daten werden dann automatisch unter DAM-Systemdaten gespeichert werden. Nehmen Sie diese Datendatei (zB Monitor 1) und ziehen in einen separaten Ordner. Dadurch werden die Rohdaten von der DAM-Software zu speichern, damit sie später verarbeitet werden kann.
4. Vorbereiten von Daten für Processing (DAM Filescan)
- Um die Rohdaten in einem verständlichen Format zu bearbeiten öffnen Sie das DAM Filescan-Anwendung und wählen Sie Select Input Data Ordner. Dann wählen Sie den Data-Ordner und die gewünschte Datei und wählen Sie die Scan-Option. Schließlich wählen Sie die bin Länge auf die gewünschte Leseperiode. Dadurch werden die Rohdaten in Parameter durch den Operator gesetzt zu organisieren und das Programm wird die in dem betreffenden Bereich gesammelten Daten zu melden.
- Wählen Sie das Ausgabedatentyp, um die gewünschte Bewegung zu analysieren Einstellung (Monitor zählt, bewegt, wohnen). Unter dem Menü zusätzliche Messwerte, wählen Sie in Summe bin (das ist, wenn der Behälter Länge größer als das ausgewählte System Leseintervall).
- Benennen Sie die Datei in geeigneter Weise und zu speichern. Die Datei wird in der gleichen Position wie der Ordner aus Schritt 3.9 gespeichert werden.
- Um Durchschnitt bewegt, verarbeiten die Rohdaten aus Schritt 4 erzeugt, um eine Tabelle in einem Tabellenkalkulationsprogramm zu erzeugen, sammeln, öffnen Sie die Datei, die zuvor gespeichert wurde (Schritt 4.3), und wenn der Import-Wizard-Fenster Text erscheint, wählen Sie Finish zum Öffnen die Daten-Dateien in einem Tabellenformat.
Hinweis: Je nach dem Datentyp analysiert, wird der Tabellen anders lesen. Typischerweise bewegt sich auf Monitor oder zählt die Zeitdauer der Studie werden numerisch erfasst werden zu messen, während jede individuelle Leserohr wird eine bestimmte Brief zu erhalten. Beim Anzeigen der Daten in der Tabelle, KZ Spalten die Steckplätze für Teströhrchen 1-16 repräsentieren jeweils. Die Zeilen die Datenpunkte gesammelt. - Wenn beispielsweise bewegt wurden für 20 min in 1 min-Intervallen gesammelt, der Mittelwert der 20 Zeilen, um eine durchschnittliche Anzahl von Bewegungen / Minute und andere Messungen zu berechnen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung der Temperaturantwortsteuer dritten Larvenstadium, w 1118, mit der Überwachungsvorrichtung, um Unterschiede in Larvenfortbewegung bei sieben verschiedenen Temperaturen ermitteln. Larven wurden gewaschen und in der DAM-Aktivität Vorrichtung platziert, wie oben beschrieben, und in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur eingestellt war. Die Vorrichtung wurde dann auf die Umwelt für 5 Minuten akklimatisieren, bevor die Aufnahme beginnt. Jede Larve wurde individuell für die Fortbewegung über einen 20 min Periode und die durchschnittliche Anzahl der Bewegungen pro Minute analysiert wurde für jedes Tier berechnet und gemittelt für jede Gruppe von 32 Tieren. Die Daten wurden analysiert und grafisch dargestellt mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Larven zeigten deutlich zunehmende Aktivität der Temperatur entsprechend erhöhten 5-35 ° C in 5-Grad-Schritten, mit Ausnahme einer Pause in diesem Trend bei 20 ° C und 25 ° C.
Um zu überprüfen, dass die Unterschiede could zwischen einer Steuerung und einer Mutante zuvor als hypo inaktive Larven (IAV 1) beschrieben sind, wurden getestet, detektiert werden. Die Daten wurden als Bewegungen / Minute für jeden der 32 Tiere analysiert und ein Mittelwert wurde berechnet. Wie in Figur 2 gezeigt, zeigt die Analyse, dass inaktive Larven waren deutlich weniger mobil als eine Kontrolle. Während sie viel kleiner sind als der dritte Larvenstadium wurde die Aktivität des ersten und zweiten Larvenstadium auch messbar, wie in 3. Die Aktivität der dritten Larvenstadium in jeder Minute der 20 min-Assay gezeigt wurde gezeigt, über den gesamten Zeitraum relativ konstant bleibt ( Abbildung 4).
Abbildung 1 w 1118 Larven Lokomotion wurde bei Temperaturen zwischen 5 ° C aufgenommen. - 35 ° C Each Spalte stellt die durchschnittliche Bewegung der 32 dritten Larven Tiere mit einzelnen Bewegungen pro Minute im Durchschnitt unter der Menge. * Alle Durchschnittswerte sind deutlich unterschiedlich voneinander außer 10 ° C und 15 ° C (p = 0,116) (Unterschiedliche Buchstaben bedeuten einen signifikanten Unterschied, Student t-Test).
Abbildung 2. dritten Larvensteuer Larven im Vergleich zu inaktiv (IAV 1) Larven bei 20 ° C. Die IAV 1 Larven zeigen signifikant weniger Mobilität im Vergleich zur Kontrolle.
Figur 3. Messung der Aktivität der ersten, zweiten und dritten Larvenstadiums über 20 min Aufzeichnungsintervall bei 20 ° C. N = 32 für jede Larvenstadium.
Abbildung 4. Histogramm anzeigt durchschnittliche Anzahl von Bewegungen in jeder Minute der 20 min Aufzeichnungsintervalls auftreten. 32 dritten Larvenstadium wurden bei 20 ° C getestet. Die rote Linie stellt die Anzahl der Bewegungen pro Minute im Durchschnitt für den gesamten 20 Minuten-Intervall.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Drosophila Activity Monitor Set-up und ihre Anbindung an das psiu Schnittstelleneinheit und einem Desktop-Computer. Das Innere des Inkubators wird dargestellt, aber während der Aufnahme den Inkubator soll abgeschaltet werden.
| Beschreibung | Parameter |
| Zeichnet Daten jedes Maleine Larve kreuzt einen Strahl und zusätzliche zählt aufgezeichnet werden, wenn die Larve bewegt sich, während in einem einzigen Strahl. | Counts |
| Zeichnet Daten nur dann, wenn eine Fliege positioniert zwischen getrennten Strahlen, ist es nicht die Bewegung innerhalb eines Strahls aufzuzeichnen. | Moves |
| Zeichnet die Tiere Position an jedem zweiten über einen Aufzeichnungsintervall. Diese Daten zeigen Wunschposition als Funktion der Zeit über den Ablauf eines Tests an jedem Sensor ausgegeben. | Wohnen |
| Diese Einstellung Analysen allgemeine Position des Tieres in der Röhre, was darauf hinweist, welcher Sensor das Tier während der Bewegung Auslösung. | Position |
| Diese Einstellung bestimmt die Häufigkeit, mit der Daten während eines festgelegten Zeitrahmen gesammelt, an die Desktop-Computer gespeichert. | Aufzeichnungsintervall |
Tabelle 1. Beschreibung der measurement Parameter (Counts, Moves, Dwell und Position).
Video 1. DAM-System Teströhrchen, bevor sie in Betriebsgerät Insertion. Die Feuchtigkeit wird durch Kondensation aus Atem zur Verfügung gestellt. Dieses Niveau ist ausreichend, um Larvenfortbewegung in der gesamten Studiendauer, ohne dass das Tier zu schweben oder schwimmen zu halten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Discussion
Aktivität von Drosophila-Larven wird von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Genotyp 8, 13 Jahre alt und Umgebungstemperatur 2 beeinflusst. Obwohl leistungsfähige videographische Verfahren in der Lage, sehr detaillierte Analyse wurden von denen, die Fortbewegung 5 studieren entwickelt worden, kann diese Detailebene überflüssig für diejenigen, die grundlegenden Parameter der Aktivität zu bestimmen wollen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Vorrichtung, die in vielen Labors ist, ist einfach zu bedienen, erzeugt hoch reproduzierbare Ergebnisse, und ist überschaubar, auch für diejenigen, deren Hauptforschungsschwerpunkt ist nicht der Fortbewegung. Die Ergebnisse zeigen, dass Beispiel dieser Assay verwendet werden, um signifikante Änderungen der Motilität in Larven auf unterschiedliche Temperaturen (Figur 1) und von verschiedenen Genotypen (Figur 2) unterzogen zu detektieren.
35 ° C, deren - wenn Larven wurden bei Temperaturen von 5 ° C gemessen,Aktivität erhöht sich mit der Temperatur, mit Ausnahme einer Unterbrechung der Entwicklung zwischen 20 ° C und 25 ° C (Abbildung 1). Es wurde von Ainsley und Mitarbeiter gezeigt, daß Futter frühen dritten Larvenstadium bevorzugen Temperaturen innerhalb +/- 2 ° C der typischen 25 ° C Kultivierungstemperatur. Wenn Larven geben wandernden Mitte des dritten Larvenstadium Phase ziehen sie jedoch etwas kühlere Temperaturen 2. Das Ergebnis stimmt mit der Beobachtung, daß die Bewegungsaktivität für die dritte Larvenstadium größer bei 20 ° C über 25 ° C ist, was darauf hindeutet, dass ein Teil der Tiere untersucht wurden in der Wanderstufe und aktiver an den kühleren Temperaturen, und in geringerem Maße bei der normale Kulturtemperatur von 25 ° C.
Dieses Verfahren bietet Einfachheit, Objektivität und robust Durchsatz, aber es gibt Grenzen. Die oben beschriebenen Anwendungen repräsentieren Tests über einen relativ kurzen Zeitraum auftreten, zum Teil, weil der aktuelle Set-up nicht prOvide Larven mit einer Nahrungsquelle. Die Sicherstellung einer angemessenen Ernährung wäre notwendig, um Veränderungen in der Aktivität über längere Zeit zu studieren oder zirkadianen Rhythmus auf längere Sicht zu messen. Die 4% Agarpfropfen kann der Gasaustausch zwischen der Kammer und der äußeren Umgebung, die in den Larven erfährt hypoxischen Bedingungen führen könnte beschränken. Dies bedeutet jedoch nicht angezeigt, um die Aktivität beeinflussen innerhalb von 20 min Test Zeitraum, denn als Durchschnitt pro Minute bewegt sich der Larven während jeder Minute des Zeitraum wurden analysiert, Larven offenbar nicht jede Änderung in der Aktivität über die Aufzeichnungsdauer zu zeigen (Abbildung 4) .
Da das Gerät Aufzeichnungen Position kontinuierlich es eine Verbesserung bei der Erfassung von mehr Bewegung im Vergleich zu den nicht automatisierten Verfahren zitiert stellt jedoch einige Bewegungserkennung funktioniert entkommen. Sehr kleine Bewegungen von Tieren keine Antwort von diesem Gerät auslösen könnten, und Larven können in einer umlaufenden Weise innerhalb eines Infrarot bewegenroten Strahl, ohne benachbarten Strahlen, was zu ungenau niedrige Messwerte. Da diese Art von Fehler zu erwarten, dass in allen Behandlungsgruppen auftreten, ist es jedoch unwahrscheinlich, zu irreführenden Ergebnissen führen. Obwohl dritten Larvenstadium der Hauptschwerpunkt dieser Analyse ist die Vorrichtung zur Messung der Bewegung des viel kleineren ersten und zweiten Larvenstadium, sowie (3). Wie erwartet, ist die Zahl der Bewegungen pro Minute in der jüngeren Tieren aufgezeichnet niedriger als die von der größeren dritten Larven Tieren.
Obwohl die vollständige Palette von Verwendungszwecken für dieses Gerät wurde noch nicht bewiesen ist, gibt es eine Vielzahl von anderen Anpassungen, die die Anwendungen dieser Vorrichtung zur Studien mit Larven diversifizieren konnten. Zum Beispiel kann das Gerät eine "Verweilzeit" Messung, die Zeit in einem bestimmten Bereich des Rohres verbracht darstellt. Dies kann wertvolle Informationen liefern, wenn in verschiedenen Drosophila beschäftigt Larven Taxis einssays. Durch Platzieren der Vorrichtung auf die Seite, so dass die Rohre vertikal statt horizontal ausgerichtet ist, könnte man Larven geotaxis messen. Um Phototaxis zu messen, einen leichten Steigung in den Rohren festgelegt werden, zu testen, ob Larven haben eine Vorliebe für Licht oder sein Fehlen. Chemotaxis zu untersuchen, kann eine Testchemikalie auf einer der Agarpfropfen und der Position der Larven gesetzt werden könnte, dann zeigen bestimmen ihre Präferenz für oder Vermeidung der chemischen.
Der Monitor-System ermöglicht die Analyse der verschiedenen Bewegungsparameter, in Tabelle 1 zusammengefasst, indem Sie alle Parameter während der Pre-Test-Setup (siehe Schritt 3.6), der Versuchsleiter können wählen, welcher Parameter nach dem Test zu analysieren. Allerdings, wenn eine Einstellung nicht ausgewählt ist, dass die Daten sind somit nicht für die Post-hoc-Analyse zur Verfügung. Es sollte beachtet werden, dass nach jedem ausgewählten Zeitperiode, Daten werden zu den jeweiligen Zählungen froren und an den Host-Computer gespeichert werden. Datenerfassung setzt dann aufNull nach dieser Zeit und beginnt erneut, Bereitstellen einer Reihe von Zeitintervalldatenpunkten. Man muss manuell beenden, um die Datenaufzeichnung zu beenden.
Zukünftige Studien im Zusammenhang mit diesem Verfahren wird auf die Verwendung der Verweilzeit Parameter und ihre verschiedenen Anwendungen zu konzentrieren. Auch kann es möglich sein, ein Protokoll, das erlauben würde, für Studien über einen längeren Zeitraum, beispielsweise circadian Studien auftreten, durch Bereitstellung von Nahrung und Austauschen Agarpfropfen für ein gasdurchlässiges Material 14 zu entwickeln. Feuchtigkeitsniveaus müssten ebenso gesteuert werden, wie trockenen Bedingungen hemmen Fortbewegung 15. Derzeit bietet das Protokoll eine präzise, einfache und kosteneffiziente Methode, um Grundparameter Larven Aktivität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu bewerten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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