Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.

Abstract

Bloed, als niet-Newtoniaanse Biofluid vertegenwoordigt de focus van talrijke studies op het gebied hemorheology. Bloedcomponenten omvatten rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes die zijn gesuspendeerd in bloedplasma. Vanwege de overvloed van de erytrocyten (40% tot 45% van het bloedvolume), hun gedrag dicteert de reologische gedrag van bloed vooral in de microcirculatie. Bij zeer lage afschuifsnelheden worden beschouwd RBC's te assembleren en maken entiteiten genoemd aggregaten, waarbij de niet-Newtons gedrag van bloed veroorzaakt. Het is belangrijk de omstandigheden van de vorming van aggregaten begrijpen om de bloedreologie microcirculatie begrijpen. De hier beschreven protocol beschrijft de experimentele procedure om kwantitatief bepalen van de RBC aggregaten in de microcirculatie onder constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerking. Hiervoor zijn RBC-suspensies beproefd en 120 x 60 urn poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) microkanalen geanalyseerd. De RBC-schorsingen zijn entgeregend gebruik van een tweede fluïdum om een ​​lineair snelheidsprofiel in het bloed laag te verkrijgen en daarmee ook de uiteenlopende constante afschuifsnelheden. De afschuifsnelheid wordt bepaald met behulp van een micro Particle Image Velocimetry (μPIV) systeem, terwijl RBC aggregaten worden gevisualiseerd met behulp van een high speed camera. De videoclips die van de RBC aggregaten geanalyseerd met beeldverwerkingstechnieken teneinde de totale weergegeven gebaseerd op de beelden intensiteit te bepalen.

Introduction

Rode bloedcellen (RBC) spelen een cruciale rol bij het bepalen van de rheologische gedrag van bloed. Zij zijn bijna singulier verantwoordelijk voor de specifieke eigenschappen van bloed in vitro en in vivo. Onder fysiologische omstandigheden, RBCs bezetten 40% tot 45% van het bloedvolume. In microcirculatie, RBCs alleen bezet tot 20% van het bloedvolume gevolg van kleinere diameters vaartuig en het plasma skimming effect 1. Dit fenomeen van een plasma vermindering microcirculatie bekend als Fåhræus effect. Bij lage afschuifsnelheden, RBCs samen kunnen overbruggen en vormen ééndimensionale of driedimensionale structuren genaamd "rouleaux" of aggregaten beperken, waardoor de niet-Newtons gedrag van bloed. Echter, het mechanisme van aggregatie RBC niet volledig begrepen. Twee theorieën bestaan ​​om het model van de aggregatie van RBC: het overbruggen van cellen theorie te wijten aan de verknoping van de macromoleculen 2 en de kracht attractie theorie veroorzaakt door afbraak van de moleculen als gevolg van de osmotische gradiënt 3.

Kenmerkend voor menselijk bloed, aggregaten bij zeer lage afschuifsnelheden 4 variërend van 1 tot 10 sec -1. Boven deze range, RBC's hebben de neiging om te splitsen en stromen afzonderlijk in het vat.

Inzicht in de voorwaarden van de aggregaten formatie is van groot belang om het veld hemorheology in termen van het bepalen van rheologische gedrag van bloed. Deze aggregaten worden vaak gezien op de macrocirculatie niveau (> 300 urn diameter) 5. Op deze schaal wordt bloed beschouwd als een Newtonse vloeistof en een homogeen mengsel. Echter, deze aggregaten zelden in het capillaire niveau (4-10 um in diameter) en die meestal een indicatie van pathologische aandoeningen zoals diabetes en obesitas 6. Andere pathologische omstandigheden dat kan veranderen RBC aggregatie omvatten inflammatoire of infectieuze aandoeningen,cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertensie en atherosclerose, genetische aandoeningen en chronische ziekten 7. Daarom is het begrijpen van de RBC aggregatiemechanisme en analyse van deze entiteiten (door het definiëren van een relatie tussen de grootte van deze aggregaten en stromingsomstandigheden) kunnen leiden tot het begrijpen van het gedrag van microrheological bloed en daarmee verband aan klinische toepassingen.

RBC aggregaten worden veranderd door verscheidene factoren zoals de hematocriet (volume RBC's in het bloed), de afschuifsnelheid, de vaatdiameter, de RBC membraan stijfheid en het suspenderende medium preparaat 8-10. Daarom zijn gecontroleerde omstandigheden vereist om effectief te analyseren RBC aggregaten. Verschillende methoden zijn in staat om aggregaatvorming analyseren door het verstrekken van statische aggregatie metingen (aggregatie index) dat relevante informatie over bloed gedrag biedt. Deze methoden omvatten, onder meer, de bezinkingmethode 11, de lichttransmissie methode 12, de lichtreflectie methode 13 en de lage afschuifviscositeit methode 14.

Weinig studies hebben geprobeerd om RBC aggregatie bestuderen en bepalen de mate van aggregatie in gecontroleerde stroom omstandigheden 15-17. Echter, deze studies indirect onderzoek RBC totale afmetingen door bepaling van de verhouding van de verblijfsruimte in een knipsysteem gemeten op basis van bloed microscopische beelden met informatie over de mate van aggregatie en de lokale viscositeit.

We stellen daarom een ​​nieuwe procedure om direct te kwantificeren RBC aggregaten in microcirculatie, dynamisch, onder gecontroleerde en constante shear tarieven. RBC-suspensies worden meegevoerd in een dubbele Y-microkanaal (zie figuur 1), met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing dus waardoor een schuifkracht in het bloed laag. Binnen dit bloed laag een constante shear tarief kan worden verkregen. De RBC-suspensies worden getest bij verschillende hematocriet (H) niveau (5%, 10% en 15%) en bij verschillende afschuifsnelheden (2-11 sec -1). Het bloed snelheid en afschuifsnelheid worden bepaald met behulp van een micro Particle Image Velocimetry (μPIV) systeem, terwijl de stroom wordt gevisualiseerd met behulp van een high speed camera. De verkregen resultaten worden vervolgens verwerkt met een MATLAB code op basis van de afbeeldingintensiteiten om de RBC's te detecteren en te bepalen totale afmetingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bloed wordt verzameld van gezonde personen met de goedkeuring van de ethische commissie van de Universiteit van Ottawa (H11-13-06).

1. Microchannel Fabrication

De microkanalen worden vervaardigd op basis van standaard fotolithografische methoden 18.

  1. Ontwerp de microkanaal geometrie met behulp van een Computer Aided Design (CAD) software en de configuratie op een transparantie foto-masker af te drukken. Deze maskers zijn van cruciaal belang, omdat zij bepalend zijn voor de lichtpad tijdens het fabricageproces. In dit geval zijn de microkanaal afmetingen 120 urn dik, 60 urn in diepte en 7 mm.
  2. In een cleanroom, een spin-coat op epoxybasis negatief fotoresist op een silicium wafer bij 2000 tpm gedurende 30 seconden om de gewenste diepte microkanaal (60 micrometer) te verkrijgen.
  3. Maak de wafer en het fotomasker onder een UV-lamp bij 650 mJ / cm2 gedurende 70 sec. Zorg ervoor dat alleen de transparante gebieden van het blootstellenfotomasker naar het UV-licht. De blootstelling van de transparante gebieden maakt polymerisatie van de ketens resulteert in een verharding van foto-resist. Dompel het silicium stuk in een ontwikkelaar om het overtollige te verwijderen van foto-weerstaan.
  4. Nadat de mal is vervaardigd, meng silicium gebaseerd elastomeer en een hardingsmiddel in een verhouding van 10: 1 tot een oplossing van poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) te creëren. Plaats de PDMS oplossing in een vacuümkamer ontgassen. Giet het in de mal en verwarm bij 60 ° C gedurende 90 min te creëren microkanalen. Obligatie dan de afzonderlijke kanalen om een ​​glasplaatje met behulp van zuurstof plasma bonding voor 90 sec.
    Opmerking: de PDMS ontgas wordt uitgevoerd teneinde de luchtbellen veroorzaakt door het mengproces te elimineren.
  5. Zorg ervoor dat de microchannel afmetingen zorgen voor een succesvolle test. In dit protocol, de microkanalen een rechthoekige doorsnede van 120 x 60 micrometer. Ter vergelijking, het gemiddelde RBC heeft een diameter van 8 urn en een dikte van 2 urn. Dewaardo or, het microkanaal breedte voldoende is om een ​​goede aggregatie observeren en snelheidsprofielen nauwkeurig te bepalen.

2. Blood Voorbereiding

  1. Verzamel bloed van gezonde vrijwillige donoren, na goedkeuring van een ethische commissie. Behandel het bloed met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in de verzamelbuizen (7,2 mg EDTA in 4 ml bloed).
    OPMERKING: Het EDTA wordt gebruikt om de bloedstolling te voorkomen.
  2. Centrifugeer de bloedmonsters drie maal gedurende 10 minuten bij 1400 xg (3000 rpm) om de bloedbestanddelen scheiden. Door het centrifugeren acht drie verschillende lagen.
    OPMERKING: De drie lagen zijn de RBC laag (aan de onderkant van de buis), de bufferlaag (bestaande uit witte bloedcellen en bloedplaatjes bovenop de RBC laag) en de plasmalaag (boven op alle overige bestanddelen).
    1. Na de eerste centrifugatie, verzamel bloedplasma onder toepassing van een pipet bloed. Vermijd contact met de bufferlaag.
    2. Verzamelen en afvoeren van de buffy coat in een container met bleekwater verdund tot 10%.
    3. Voeg 3 ml PBS pH 7,4 aan elk van de buizen met de overgebleven RBC laag en de goede evenwicht van de centrifuge. Meng de buizen en centrifugeer weer bij 1400 xg (3000 rpm) gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Zorg dat de PBS-oplossing geen magnesium of calcium bevat, omdat zij de celadhesie kunnen veranderen.
    4. Gooi de PBS in de buizen na de tweede centrifugeren en verwijder de resterende buffycoat indien aanwezig. Herhaal stap 2.2.3 en 2.2.4 voor de derde centrifugeren om schone RBC opleveren.
  3. Meng de benodigde hoeveelheid (0,05, 0,1 en 0,15 ml) van de schone erytrocyten met plasma (0,95, 0,9 en 0,85 ml) in een 1 ml tube om RBC-suspensies verkregen met de overeenkomstige (5%, 10% en 15% ) hematocriet. Controleer hematocrietwaarden met een microcentrifuge.

3. Vloeistoffen Voorbereiding

  1. Voeg 60 ul van de fluorescerende tracer deeltjes-oplossing (1% vaste stof, deeltjes d = 0. 86 urn, abs λ = 542 nm en λ emissie = 612 nm) in de 1 ml RBC-ophanging buizen.
    OPMERKING: De fluorescerende tracer deeltjes (intern geverfd polystyreendeeltjes) worden gebruikt om de snelheid van de gasstroom in de microkanaal meten. Deze deeltjes fluoresceren wanneer ze worden blootgesteld aan de overeenkomstige golflengte van de laserbundel (λ = 542 nm).
  2. Bereid een PBS-pH 7,4 oplossing en voeg 60 ul van dezelfde fluorescerende tracer deeltjes oplossing in 1 ml van de PBS-oplossing.

4. Aggregaten Size Metingen

  1. Om de vloeistoffen (RBC-schorsingen en PBS) in het microkanaal te voegen, gebruik maken van twee glazen spuiten van 25 ul en 100 ul. Dit zalhelpen om de naleving van het systeem te verminderen. Sluit het microkanaal naar het spuiten via leidingen en aansluitingen passend bij de ingang gaten. Vul het glas spuiten via het drukverschil bestaat tussen de vloeistofhouder en de spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Als een alternatieve methode, gebruik dan een systeem met drukregeling beide vloeistoffen te rijden in het microkanaal.
  2. Plaats de microkanaal op een omgekeerde microscoop podium verbonden met een high speed camera en een μPIV systeem. Programmeer de spuit pomp naar de gewenste debieten (bijvoorbeeld Q = 2 pl / hr voor bloed veroorzaken van een debiet van Q = 8 ul / hr voor PBS).
    OPMERKING: Slechts één spuit pomp wordt gebruikt. Met behulp van twee verschillende glazen spuiten met twee verschillende inwendige diameters, is het mogelijk te variëren de debieten invoeren van elke tak van de Y-microkanaal.
  3. Steek beide fluïda in een dubbele Y-microkanaal elk uit een andere ingang kantoren en op verschillende debieten zie 19 (figuren 2 en 3). Wacht tot de stroom naar stabiele toestand te bereiken voordat het verwerven van de metingen: visueel te inspecteren de high speed camera beelden voor een vlotte doorstroming.
    OPMERKING: De verhouding is cruciaal verkrijgen lineair snelheidsprofiel in het bloed laag.
  4. Visualiseer de RBC met behulp van de high speed camera. Sluit de camera aan op een computer te controleren, opnemen en opslaan van de beelden van de vloeistofstroom. Zodra de twee vloeistofstromen steady state te bereiken, beginnen met opnemen.
    1. Acquire meerdere beelden voor een betere verwerking van resultaten. Bepaal een optimale blootstelling camera voor een duidelijk beeld van de aggregaten.
      OPMERKING: De tijd blootstelling camera voor dit geval was 0,5 msec. De keuze van de tijd interval tussen elk frame gebaseerd op de framesnelheid camera en de stroomsnelheid in thij microkanaal. De tijd tussen elke verwerkt deze procedure frame was 60 msec. Daarom is een camera kan opnemen 18 frames per seconde volstaan.
      OPMERKING: Vermijd het bloed bezinking in de buis en spuit, die kunnen leiden tot foutieve metingen.
  5. Met behulp van beeldverwerkingstechnieken (a MATLAB programma in dit geval) om de beeldkwaliteit te verbeteren, detecteren de aggregaten in elk van de beelden op basis pixelintensiteiten (geïllustreerd in figuur 4) als volgt:
    1. Verbeter de beelden contrasteren met behulp van het histogram equalizer methode om een ​​betere beeldkwaliteit voor elk frame te verkrijgen.
    2. Zet de grijstinten beelden in binaire beelden. Daartoe stelt een drempelwaarde, variërend van 0 tot 1, dat de omzetting van elke pixel dicteert. Elk pixel in de afbeelding onder de drempelwaarde wordt gedetecteerd als een zwarte pixel, terwijl de pixels met waarden hoger dan de drempelwaarde wordt gedetecteerd als witte pixels.
    3. Vul hetholes (indien aanwezig en noodzakelijk) overeenkomend met de openingen binnen een geaggregeerde voor betere resultaten.
    4. Detecteren de cellen door het bepalen van de naburige witte pixels in het binaire beeld, zodat aangrenzende cellen in verband worden gebracht als aggregaten.
    5. Label de verschillende aggregaten gedetecteerd en zetten de binaire afbeelding in een afbeelding rood-groen-blauw (RGB) voor een betere visualisatie. Combineer de originele frames met elk van de overeenkomstige verwerkte beelden naar de efficiëntie van het beeld verwerkingstechniek verifiëren en te waarborgen dat alle cellen in aanmerking worden genomen, zie figuur 5. Voer stap 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 en 4.5.5 van alle frames vastgelegd.
    6. Bereken de oppervlakte van elke waargenomen binnen het kader gebaseerd op het aantal gedetecteerde pixels aggregaat. Op basis van de lens vergroting Bereken, de conversiefactor, met een kalibratie reticule, en zet het resultaat om 2 pm. Het gemiddelde van de totale grootte gedetecteerd in elkframe en dan het gemiddelde van de resultaten voor alle frames om de gemiddelde totale grootte voor elke opname van RBC-schorsingen te verkrijgen.
    7. Bereken de oppervlakte van een RBC aan een vertegenwoordiger geschatte aantal RBC bepalen binnen elke gedetecteerde aggregaat. Deze onderzoeksresultaten Bereken de verdeling van het percentage rode bloedcellen in elk aggregeren als een functie van de totale afmetingen (weergegeven door het geschatte aantal cellen per aggregaat), zie figuur 6.
      OPMERKING: Om de RBC aggregaten te meten, kon ImageJ software worden gebruikt (in plaats van MATLAB) om dezelfde taken op elk frame te voeren.

5. Fluid Velocity en Shear Rate Metingen

Bepaal de fluïdumsnelheid en derhalve de afschuifsnelheid met een μPIV systeem.

  1. Zodra de gegevens zijn verkregen met behulp van de high speed camera, schakelen naar de dubbele pulserende camera gebruikt voor de μPIV systeem. Gebruik een imaging software voor het acinquisitie van de stroming en de beeldverwerking voor snelheid veld bepalen.
  2. Neem alle nodige voorzorgsmaatregelen, afhankelijk van de klasse van de laser, alvorens de laser. Zet vervolgens het systeem, de camera en de laser.
  3. Kalibreer de camera op basis van de lensvergroting gebruikt. Hiervoor gebruikt microschaal van 10 urn nauwkeurig onder de microscoop en de grootte van 1 pixel in het beeld.
  4. Start de laser en visualiseren van de deeltjes in beide vloeistoffen. Vind het middenvlak van het microkanaal met name gaan snelste deeltjes in de stroom (dat wil zeggen, de snelste deeltjes dienen de helderste zijn).
  5. Stel de dt (tijdsinterval tussen twee opeenvolgende frames) voor de juiste verplaatsing van het deeltje te waarborgen. De snelste deeltjes moet bewegen 5-10 pixels tussen beide beelden.
  6. Beginnen met het opnemen van de stroom. Stel de software 100 paren van beelden, 5 msec apart verkrijgen. Voer stappen 5.4, 5.5 en 5.6 voor alle diflende RBC-schorsingen en voor verschillende afschuifsnelheden.
    OPMERKING: Meer bijzonderheden omtrent de methode worden gegeven in de studie van de Pitts en Fenech 20.
  7. Verwerk de verkregen met behulp van de cross-correlatie methode met de imaging software opnames.
    Opmerking: Deze bestaat uit discretiseren van het paar beelden in kleine ramen van vooraf bepaalde grootte (gebaseerd op de fluïdumstroom en het tijdsinterval gekozen door de gebruiker) genoemd correlatie ramen en na de verplaatsing van de deeltjes in elk venster.
    1. Bepaal eerst of de verkregen beelden vereisen pre-processing (inclusief achtergrond aftrekken, "base-clipping" 21 of afbeelding overlappende 22,23) voor een betere verwerking van gegevens.
    2. Kies vervolgens het correlatievenster grootte en vorm, alsook het percentage overlappende beelden. Een gedetailleerde studie werd uitgevoerd door Pitts et al. 24 om de optimale parameters en het pre-processing technieken voor het bloed te bepalenstromen in verschillende kanalen configuraties. Geef de resultaten als een gemiddelde snelheid veld berekend uit de 100 image paren en de Root Mean Square (RMS) fout in snelheid.
  8. Extraheer een snelheidsprofiel bij de kanaaluitlaat, uit de verwerkte data zoals getoond in figuur 7. Voor een beter profiel gemiddelde snelheidsveld in de ruimte.
    OPMERKING: De staven waaruit de snelheidsprofiel overeen met de correlatie venstergrootte opzichte van de kanaalbreedte opstelling. De RMS fout in snelheid wordt ook getoond in figuur 7, die de fout in de experimentele velocity schatting.
  9. Schakel de laser nadat alle metingen en verwerking worden uitgevoerd ,. Schakel alle componenten van het systeem: software, camera's, bewegende fase computers en laser.
  10. Om de shear berekenen, de eerste sporen en een schatting van de dikte van bloed in de microkanaal gebaseerd op de high speed camera opnemen. Hiertoe gemiddeld allede frames in de specifieke opname op een achtergrond beeld van de video te verkrijgen. Baken het bloed laag (zie figuur 8 voor de RBC-suspensies stroomsnelheid van 10 gl / uur bij suspensie bij 5%, 10% en 15% hematocriet). Het verkrijgen van de velocity waarde voor de overeenkomstige dikte van bloed laag en het berekenen van de afschuifsnelheid door de velocity waarde te delen door de dikte bloed laag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een voorbeeld van het twee-vloeistofstroom in een dubbele Y-microkanaal wordt getoond in figuur 2 van menselijke RBCs wordt om 5%, 10% en 15% hematocriet en een stroomsnelheid van 10 ul / uur. Figuur 3 toont het verschil in totale grootte bij de stroming in het kanaal wordt verlaagd van 10 ul / uur tot 5 pl / uur gedurende een hematocriet van 10%. Dit geeft een kwalitatief begrip van de grootte van de aggregaten bij wisselende hematocriet en afschuifsnelheid. Figuur 5 volgt de verplaatsing van vier humane RBC aggregaten gedurende drie opeenvolgende frames, die een kwalitatieve maat voor de camera frame rate nodig is en kwalitatief begrip aggregaten verdeling binnen elk frame. In figuur 5 zijn de kleine aggregaten (met 8 of minder geschatte RBC's) worden in blauw, terwijl medium aggregaten (bereik 9-30 geschatte RBC's) en grote aggregaten (groter dan 30 ongeveer RBC's) worden getoond in respectievelijk groen en rood.

figuur 7, waar de rode, blauwe en groene tonen de de snelheidsprofielen van de RBCs wordt om 5%, 10% en 15% hematocriet respectievelijk. De RMS fouten van de snelheid, ook weergegeven in figuur 7 voor elke RBC-suspensie, relatief klein in vergelijking met de snelheidswaarden en geeft de nauwkeurigheid van de snelheidsmetingen en dus afschuifsnelheden. De interface locaties worden aangeduid als "E" en getoond als getrokken lijnen in dezelfde figuur.

De overeenkomstige afschuifsnelheden de verschillende RBC-suspensies (gebaseerd op de snelheidsprofielen en de dikte bloed laag) getoond in tabel 1. De gemiddelde totale afmetingen bepaald voor elk van de RBC-suspensies op basis van de beeldbewerkingsmethode voor het detecteren gebied van de RBC aggregaten worden getoond in figuur 9, als function van de overeenkomstige afschuifsnelheid. Een voorbeeld van de verdeling van het percentage rode bloedcellen in elk aggregaat wordt getoond in figuur 6. De totale afmetingen zijn weergegeven als een geschat aantal RBC in de aggregaten.

Figuur 1
Figuur 1. Double Y-microchannel configuratie en de toegang vloeistoffen. Bloed in de eerste vestiging bij Q = 2 pl / uur terwijl PBS komt in de tweede vestiging bij Q = 8 ul / uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Menselijke RBC-suspensie op verschillende hematocrit. De figuur vertegenwoordigt gemaakte opnamen van de humane RBC-suspensies stroomsnelheid van Q = 10 ul / uur bij (A) 5% (B)10% en (C) 15% hematocriet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Human RBC-suspensie bij verschillende debieten. De figuur vertegenwoordigt gevangen frames van de menselijke RBC geschorst tot 10% hematocriet H stroomt (A) Q = 10 pl / hr en (B) Q = 5 ul / uur. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Flow grafiek van de beeldverwerking programma dat gebruikt wordt voor het aggregaat detectie. De getoonde beschrijven de basismethodiek stappen. De kwaliteit van het beeld wordt verbeterd c zijn onverted naar een binair beeld. De aggregaten worden gedetecteerd en geëtiketteerd op basis van hun respectieve grootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. RGB kleuren en de netto-beweging van de verschillende menselijke RBC aggregaten gedurende drie opeenvolgende frames. De figuur toont de netto beweging van vier aggregaten gedetecteerd in drie opeenvolgende frames op (A) t = 0 msec, (B) t = 60 msec en (C) t = 120 msec. De grote aggregaten (> 30 geschatte RBC's), medium aggregaten (9-30 geschat RBCs) en kleine aggregaten (<8 schatting RBC) getoond in respectievelijk rood, groen en blauw. Elke gedetecteerde aggregaten zijn aangegeven met een zwarte cirkel._blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. RBC aggregaat grootteverdeling voor 10% H RBC-ophanging voor verschillende debieten. Aggregate grootteverdeling voor bloedstalen geschorst tot 10% H, stroomt bij Q = 10 en 5 ul / uur. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 7
Figuur 7. Velocity profiel vergelijking voor verschillende hematocriet. Zijn De snelheid profielen getoond voor RBC in plasma geschorst tot 5% H (rood), 10% H (blauw), 15% H (groen) en simulatie 19 (vaste lijn) voor de 120 x 60 micrometer dubbele Y-microkanaal met een Q = 10 ul / uur. De interface locatie wordt aangegeven met E van deexperimenten. De bijbehorende RMS fouten van de verschillende snelheid profielen worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Afbeelding achtergrond voor de verschillende RBC-ophangingen en afbakening van de dikte van het bloed laag. De figuur toont de afbakening van de dikte van de RBC-schorsingen stroomt bij 10 ul bloed laag / uur geschorst (A) 5%, (B ) 10% en (C) 15% H. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9
Figure 9. gemiddelde totale afmetingen als functie van de overeenkomstige afschuifsnelheden. De resultaten worden verkregen voor de verschillende RBC-ophangingen stroomt bij Q = 10 ul / uur bij 5% (A), 10% (B) en 15% H (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hematocriet Debiet (pl / hr) Afschuifsnelheid (sec -1)
5% 10 11.02
5% 5 5.36
10% 10 8.17
10% 5 4.47
15% 10 7.41
15% 5 2.51

Tabel 1. afschuifsnelheid voor verschillende bloedstroom cases. Worden de afschuifsnelheid waarden verkregen met de μPIV data en beeldverwerking resultaten voor verschillende RBC-suspensies met 5%, 10% en 15% H, Q = stroomsnelheid van 10 gl / hr en Q = 5 ul / uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met de onderhavige werkwijze is het mogelijk om kwalitatief en kwantitatief analyseren RBC aggregaten onder verschillende stroomomstandigheden en hematocriet. Voor uitvoering van de controle en geaggregeerde detectie, is het cruciaal om de juiste snelheidsverhouding tussen de twee fluïda te bepalen bij het microkanaal ingang. Deze verhouding is belangrijk voor een optimale dikte bloed laag waar het snelheidsprofiel quasi-lineair 19 verkrijgen.

Een andere belangrijke factor voor een succesvolle test is een goede beeldkwaliteit. In feite, aangezien de methode berust op beeldverwerking, is het erg belangrijk om een ​​contrast tussen de beeldachtergrond (de vloeistof in het kanaal) en de deeltjes te detecteren zijn. Hier, zoals getoond in figuren 2 en 3, de deeltjes zichtbaar donkerder dan de achtergrond, die helpt bij het ​​aggregaat te detecteren. De belangrijkste parameter te overwegen voor de beeldbewerkingstechniek de threshold waarde. Daarom, gebaseerd op de verkregen contrast is het cruciaal om de optimale drempelwaarde wanneer de aggregaten in aanmerking worden genomen, zoals in figuur 5 te kiezen. De onderhavige beeldsegmentatie, gebruikt voor deze studie, wordt veel gebruikt voor mobiele detectie en tellen 25- 27. Indien de kwaliteit van het beeld niet zoals gewenst en een globale drempelwaarde niet geschikt is, kan men een ander algoritme om de optimale drempelwaarde vastgesteld zoals Otsu de werkwijze 28 of een adaptieve drempelwaarde methode (discretiseren van het beeld en het verkrijgen van een lokale drempel voor elk gediscretiseerd venster).

Een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de schaalfactor voor een goede omzetting van pixels tot urn.

De juiste omzettingsfactor, kan men de diameter en de dikte van een RBC die het mogelijk maakt de totale grootteverdeling vast te stellen (op basis van de geschatte number van RBC in elk aggregaat). Afhankelijk van de oriëntatie van de aggregaten, juiste berekening van de omgeving op een RBC (vooraanzicht of zijaanzicht). Zoals in paragraaf 4 (stap 4.4.1), is het belangrijk om de juiste belichting tijd en de framesnelheid te bepalen dat de dynamiek van de aggregaten worden gevangen tussen elk opeenvolgend frame. Deze waarde is gebaseerd op het debiet gebruikt bij het verkrijgen van de metingen. Verschillende andere factoren rekening moet worden gehouden bij het ​​verwerven van resultaten met behulp van de μPIV systeem en zijn duidelijk besproken in de studie van Pitts en Fenech 20.

De methodologie is met succes getest op verschillende RBC-schorsingen stroomt op verschillende hematocriet. Vanwege de beperking van het beeld verwerkingstechniek en het gebrek aan contrast tussen de achtergrondafbeelding en aggregaten, moeilijk te detecteren RBC aggregaten van hogere hematocriet (van 20% tot 45%). Indeed genoemdeEerder, de beeldkwaliteit is cruciaal voor deze methode.

Met dit protocol kan de RBC totale afmetingen worden gemeten in een gecontroleerde microfluïdische apparaat en dus is het mogelijk om informatie te verkrijgen over dynamische RBC aggregatie in microcirculatie en het verkrijgen van de totale RBC maten voor verschillende fysiologische afschuifsnelheden. Het is ook mogelijk om numerieke en experimentele studies van bloedreologie vullen en verbinden de totale afmetingen en gedrag klinische en pathologische studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. Microfabricage werd uitgevoerd met de steun van de McGill nanotools Microfab faciliteit aan de McGill University en de vakgroep Elektronica aan Carleton University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

Bioengineering Rode bloedcellen aggregatie microcirculatie microfluidics micro particle image velocimetry bloedreologie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter