Summary
小胶质细胞活化和小神经胶质细胞是关键应对慢性神经退行性病变。这里，我们提出在体内 ，视网膜CX3CR1-GFP +胶质细胞共聚焦检眼镜的长期可视化方法，以及用于阈和形态分析，以确定和量化它们的活化。我们监测期间与年龄有关的青光眼的早期阶段小胶质细胞的变化。
Abstract
小胶质细胞，这是CNS驻地神经免疫细胞，改变其形态和大小响应中枢神经系统损伤，切换到激活状态具有不同的功能和基因表达谱。在健康，损伤和疾病胶质细胞活化的作用仍然不完全是由于他们的动态和复杂的调节反应的变化在他们的微环境的理解。因此，它是对非侵入性地监控关键和分析在完整生物体随时间的变化小胶质细胞活化。在体内胶质细胞活化的研究已经被推迟了技术限制，以跟踪小胶质细胞的行为没有改变中枢神经系统环境。这已经在慢性神经变性，在那里长期变化必须跟踪是特别具有挑战性的。视网膜，中枢神经系统器官适合于非侵入性的实时成像，提供了强大的系统，以可视化和在慢性病症表征小胶质细胞活化的动力学。
在体内成像的视网膜小胶质细胞，使用共聚焦检眼镜（CSLO）和CX3CR1 GFP / +报告小鼠，以可视化的小胶质细胞与细胞的分辨率的方法。此外，我们描述的方法来量化细胞活化和密度大细胞亚群每月改变（每视网膜200-300个细胞）。我们确认使用常染色体区域的作为用于在视网膜小胶质细胞活化的活跟踪一个有用的度量通过施加在体内图像的自动阈值基于形态测定分析。我们使用这些实时图像采集和分析的策略中的视网膜神经变性的慢性青光眼的小鼠模型的早期阶段，以监测小胶质细胞活化和小神经胶质细胞的动态变化。这种方法应该是有用，调查小胶质细胞在慢性中枢神经系统疾病，影响视网膜和视神经的神经元和轴突下降的贡献。
Introduction
小胶质细胞是自早期胚胎发育和整个成年期，专门驻留在中枢神经系统（CNS）神经免疫细胞。配备有受体的复杂剧目，小胶质细胞的活性和区域的异质性是由他们的双向相互作用调节与相邻的神经元，神经胶质细胞，血-脑屏障和渗透神经炎性细胞1,2-。小胶质细胞基础功能有助于生理保养和维修，因为他们品尝其领土的动态平衡3,4扰动。在中枢神经系统损伤或疾病，小胶质细胞是第一个响应者的神经信号，然后触发他们过渡到无功表型，被称为“激活小神经胶质细胞2,5-7。小胶质细胞活化涉及基因和蛋白的表达，其耦合到细胞胞体和过程调整大小和重塑6-9的一个复杂的循环。小胶质细胞的活化，以及细胞和再分配聚类，可伴随在细胞的数量（称为小神经胶质细胞）的本地整体增加。这可能是由于细胞增殖和自我更新，有或没有招募的血液衍生的单核细胞3,4,7,10-14。在范围广泛的年龄依赖性，慢性CNS疾病，持续小神经胶质细胞和小胶质细胞活化平行疾病进展15-19。小胶质细胞是如何影响神经退行性疾病仍不清楚，主要是因为他们玩，可能有疾病发生，发展多样化的贡献都神经保护和有害的作用。实时成像旨在了解的慢性CNS疾病监测了动物模型和人类的受损中枢神经系统的小神经胶质的行为，并证明了小胶质细胞的改变是可检测的开始在早期疾病阶段15-17,19,20。因此，关键是要开发的方法来检测和监测体内小胶质细胞活化。
无创DETE在脑小胶质细胞激活区域变化ction确立为在神经变性疾病的进展体内指示器的重要，使用分子成像或生物发光和正电子发射断层扫描或磁共振成像18,21,22。这些高度量化和非侵入性的分子和核成像方法检测胶质细胞增生与区域分辨率。或者，在CX3CR1 GFP / +小鼠的双光子共焦成像已经允许大脑胶质细胞的观察与细胞分辨率3,4,9,20,23-28。然而，这种方法限制了长期和反复观察慢性小胶质改建，由下式给出甚至微创脑成像程序29干扰它们的行为的潜在风险。或者，视网膜提供了直接的最佳条件， 在体内的可视化和小胶质细胞在其完整的CNS利基整个老化重复监控，急性损伤，并潜在期间慢性神经变性疾病。因此，最近的研究证明了视网膜小胶质细胞表达GFP的高分辨率成像的可行性，通过调整共焦激光扫描眼底镜（CSLO）图像实时CX3CR1 GFP / +小鼠。这已被用于跟踪在个体小鼠长达10周的GFP +细胞数每周改变以下急性诱发损伤或高眼压30-36。
我们已经扩展这种方法来进行长期的成像历时数月，并定量跟踪的基础上利用形态分析胞体大小小胶质细胞活化的变化。常染色体的大小被定义为小胶质细胞活化在实时成像研究使用皮质切片双光子激光共聚焦显微镜 CX3CR1-GFP +小胶质9 体内成像执行有用的指标。这些和其他的研究也证实常染色体大小和Iba1蛋白表达水平之间的相关性，的wh脑出血也随着活化9,37。因此，活化的小胶质细胞可在活体小鼠来鉴定，并且它们的数量和分配过程中的CNS健康和疾病随时间监测。
这个协议描述为CSLO实时图像采集和分析方法，监测小胶质细胞的数量，视网膜神经节细胞（RGC）变性（ 图1）中的分布和形态的活化。因此，本研究的用途：1）遗传性青光眼（DBA / 2J），该发生年龄依赖性视神经和视网膜神经变性和小鼠模型显示5和10个月38,39年龄之间显着的可变性疾病进展，2）每月CSLO 体内成像的GFP +细胞在视网膜长期可视化和杂CX3CR1 GFP / + DBA / 2J小鼠的年龄3-5个月，3）由分段和阈值实时成像分析以分离细胞胞体和测量无髓鞘视神经该IR区。施加这些策略在慢性青光眼的早期阶段，以评估视网膜小胶质细胞激活状态的动力学。
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Protocol
在活体成像使用犹他州大学批准的机构动物护理和使用委员会协议无致病菌设施进行。
注意：此成像协议用于报告小鼠中视网膜小胶质细胞和浸润的单核细胞/巨噬细胞表达的fractalkine的受体基因座（CX3CR1）的控制下，绿色荧光蛋白（GFP）。
1. 在视网膜GFP +小胶质细胞的体内成像共聚焦扫描激光眼底镜检查（CSLO）
- 转水控制的加热系统，建立稳定过程中，35〜37ºC鼠标之间的温度，并连接两个加热垫。
- 启动共焦扫描激光检眼镜（CSLO）系统（ 图2A）。打开CSLO程序，输入，将确定个人鼠标设置为2毫米（患者数据菜单）角膜曲率的信息。
- 准备IMA更改。安全地装配在其插槽干净55º宽视场物镜。通过确保加热垫铺上干净的纸准备眼底成像平台。使用夹子拼合垫和纸张，并保持他们从挡住物镜的移动。
- 通过腹膜内注射1.3％2,2,2-三溴乙醇和0.8％的叔戊醇麻醉小鼠（250毫克/千克体重;0.5毫升/ 25克体重），使用30½ģ针装到1毫升的一次性注射器。返回鼠标笼子里，不停地在一个加热垫。
注：在麻醉注射与吸入的交付使鼠标成像和通畅的进入眼中，免费的鼻锥体和管更容易定位。 - 一旦动物会不动，是没有响应于尾捏，诱导瞳孔扩大与托品和苯（各0.5％），通过定位动物俯卧和覆盖双眼用的液滴7分钟。
- 5分钟后，对花边鼠标俯卧在眼底平台的中心，适合隐形眼镜了双眼，将最小的压力。
注：隐形眼镜小且脆弱，但可以用手指小心处理，虽然镊子可以用来代替40。使用隐形眼镜是可选的，但是推荐，因为它最大限度地减少眼干涩和成像过程中保持角膜透明。 - 7分钟后，定位鼠标与右眼面对物镜和平行于物镜的轨道，保持无节制的平台（ 图2B）的边缘附近的动物。收集可比饱和度和取向的图像，不断维持从眼睛到物镜的距离，以及眼睛的对准的光路整个成像会话。剪贴长须与观察眼睛的干扰。
注：在接下来的8-10分钟，鼠标不移动或闪烁，并会呼吸，轻轻动ments，这是由CSLO眼睛跟踪技术（自动实时）模式，其调节基于眼底标具有高对比度的扫描头的位置进行跟踪。过去的那个时候，老鼠开始喘气和眨眼，使成像不切实际的。 - 如果不使用隐形眼镜进行成像，应用PBS下降到双眼每隔2-3分钟，以防止它们干燥。
- 收集的视网膜血管和视盘的眼底图像，聚焦在视网膜内层。
- 选择红外模式（IR）和调整设置到820纳米的激发，100％的激光功率，40-60％的敏感性（ 图2C）。
- 工作在高速模式（12.6帧/秒），使用操纵杆来驱动眼底镜定位眼球。在低放大倍数，检查角膜和晶状体用于损伤或不透明，并且从研究眼睛排除具有缺陷或损伤，将影响成像的视网膜（ 图3A）。
- 定位视盘区域（表面视神经乳头，ONH）通过使目标更接近眼球，然后居中在图像上，并通过拧操纵杆锁定这个位置。眼睛的眼底的这种对齐是关键，甚至获得整个图像聚焦和发射。
- 可视化的视网膜的内面，以及视盘，使用位于在视网膜上作为参考焦平面（59和60 D）中，或更深（55 D）的玻璃体表面上的主要血管中的眼睛表示挖掘视神经光盘。最佳的重点应该在解决主要血管循环血细胞，用自己的管腔和墙壁明显不同。
- 优化图像饱和度调节触摸屏控制面板上的旋钮，直到均匀照明的白色光晕在大多数视盘周围的55º眼底场的跨越（使用轻微过曝）。接着，降低饱和度，以优化对比度直到血细胞沿大血管运动可以清楚地分辨。如果震源深区坚持，不能因视网膜损伤，重新调整眼相机获得均匀明亮的图像，直到。这种调整是根本捕捉重现的图像集的位置和质量。
- 收集中心视网膜的高分辨率红外图像（1.4-1.7毫米直径，这取决于年龄），平均实时30帧（4.7帧/秒;归一化），以提高信噪比（ 图2D ）。
- 立即，获得的GFP +小胶质细胞和/或局部视网膜和视盘的内面浸润的单核细胞的荧光图像。
注：视网膜的红外眼底图像的优化确定的GFP +细胞的荧光图像的分辨率，以及内层视网膜的程度跨越。未能集中在视网膜上，其可通过脉管系统的分辨率差被检测的内面，将导致在调暗的GFP +细胞视图（ 图3B）。未能调整IR凡城配给正确且均匀地影响荧光图像（FA），引入在GFP +细胞的强度和大小（ 图3C）人为的变化。- SWICH至荧光成像模式（FA）中的触摸屏面板，使用蓝色，488 nm激光激发（460-490毫微米阻挡滤波器集合），并采集设置（100％的激光功率和100-125％的灵敏度），其被保持常数所有小鼠（ 图2E）。
- 收集单一的XY点，视网膜的二维荧光图像，并立即在同一位置拍摄眼底图像（100倍的扫描平均水平; 55°扫描角度为两个图像; 图2F）。
- 通过在控制面板（ 图2G）选择“复合”和移动眼底镜左，右，平移整个鼻时间轴（ 图2H）视网膜捕获图像多。
注：扫描单XY-点图像后（100X s可以平均值），该软件自动实时平均值相同，新领域（外有绿色圆圈新的扫描过程中最佳的扫描，或当扫描不可行红色），和所有的针XY-位置。所得到的复合图像跨越1.5-1.7毫米的水平轴x 3-4毫米，在垂直轴（55°x120-124º扫描角）。
- 每只小鼠在15分钟内诱导麻醉，闪烁，运动前重新启动完成后成像。
- 取下隐形眼镜，眼睛水合物用PBS和动物返回到其回暖笼子，检查行为，直到蠕动完全恢复。
- 对于采用间歇CSLO成像会话在同一个体小鼠的纵向研究，重复成像不少于3天开以避免麻醉的蓄积毒性，以及角膜刺激。
2.实时图像处理和分析
- 连续的图像对齐：
- 对齐眼底图像用血管和视盘作为路标的时间序列相同的眼球。在商业幻灯片放映演示程序，通过拖动每幅图像比前一个，直到他们视盘对准在XY-平面（顶部图像出现半透明的同时拖动），然后旋转顶部图像，直到所有打开的图像主要血管重叠下面（集中在船只最远从视盘）的图像上的血管。记录每个图像的旋转角度和保存这个时间序列以供将来参考，跟踪鼠标和眼睛的身份。
- 通过将记录角度来校正在每个时间点在xy旋转，使用一个光栅图形编辑程序对准相应系列的单的xy点的荧光图像。此外，调整分辨率为300 dpi（不缩放）和背景（在RGB模式下，选择级别和品尝血管黑色的流明）。保存这些图片为TIF文件，加入“结盟”到他们的名字。
- 胶质细胞分割：
- 以确定的GFP +细胞在中心视网膜，在FluoRender开放对应于最早的时间点/年龄的“对准”的TIF文件。缩放图像以适应屏幕，然后定义渲染视图（复合材料，正交，插值）及其属性（0.58伽玛，饱和度255点，255的亮度，195α和1.00色带所示），同时选择了RG渠道可见（隐藏双击它，在工作区框架B通道; 图4A）。
- 选择单个细胞，阈红色通道（必须在工作空间框架中突出显示），通过增加低阈值，直到大部分细胞被屏蔽（白色）与最小的重叠和细胞过程（青色），同时保持高的阈值恒定（255）。介于100和170中的低阈值而变化，这取决于荧光强度（ 图4B </ STRONG>）。
- 保存这一观点与红色通道仅可见（捕获命令）作为一种新的TIF文件，添加“cellsegm”到原来的名称（ 图4C）。使用通用光栅图形编辑软件，它的反转灰阶调整分辨率为300 dpi的上面，并重新保存为RGB（ 图4D）。
注意：删除文件夹（项目）由FluoRender自动创建，并保存备查应用门槛。
- 小胶质细胞胞体分割和形态：
- 以确定的GFP +细胞胞体为区域量化，使用图像分析软件以自动强度测量和阈值的功能，以及基于阈值的对象计数和测量。打开“cellsegm”TIF文件，并选择重调方法（样条）和红色通道（点击RGB红色标签）。通过取消选择“彩色视图通道”提高可视化（右键单击红色的RG乙标签），并选择“补色”（图像/调整图像）反转灰阶，看到了细胞的灰色/黑色在白色背景（ 图4E）。
- 校准图像以1.4-1.7毫米取决于年龄，通过绘制一条水平线整个图像（校准，连结校准）。
- 段个别细胞胞体通过施加强度阈值（ 图4B）。对于这一点，在红色的RGB通道的工作，并打开阈强度函数（对象计数;选择“计数更新”命令），以便跟踪二维参数的感兴趣区域（ROI），每个阈值区域表示各个胞体。
- 限定在所述强度直方图的亮度临界值，通过选择255层次的最低50-60％，并通过目视评价阈颜色掩模（蓝色）和胞体周长（灰色）之间的重叠精炼最终阈值单个细胞（Figure 4E）。
- 估计胞体掩模的精度来代表常染色体的尺寸由前测量区和后分割在10个细胞，并接受所选择的阈值范围内，如果测量相差低于10％（使用的二元工具栏和注释测量值）。
- 手动识别常染色体的ROI包括多个细胞，并分离这些元件（消除或分开的ROI使用二元工具栏的控制，或在对象目录）而切换接通/断开的二值直接可视化的细胞（ 图4F）。
- 分类小神经胶质细胞为感兴趣区与常染色体区域且小于50-60微米2以鉴别细胞胞体对应于激活的小胶质细胞和分别停用小胶质细胞，通过使用区域限制。
注意：每个细胞常染色体子集被标识与不同的伪彩色二进制层，并且可以进一步表征为其它形态参数（PERIME之三，圆等 ），以及离散的视网膜扇区（ 图4G）内量化。所分析的图像保存为一个文件ND2。 - 验证过程和分支的复杂性在个别激活小神经胶质细胞，通过覆盖在面膜常染色体和单XY -点图像（对比度提高了50％; 图4H）。手动计数从细胞胞体直接延伸的处理或测量多边形包围心轴（使用二元工具栏和注释测量值）的直径。
注：活性细胞缺乏过程或承受几（<4）和短（<2×常染色体直径）的人，而相比之下，非活化细胞过程，其包括一个网状和广泛乔木（> 3 - 10倍常染色体直径）周围的相对小胞体。 - 手动识别细胞胞体小于<20微米2和/或GFP表达低于检测极限，因此这是由在未被发现张力阈值。在使用的注解命令分类计数人工识别元素。
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Representative Results
我们最近在体内的研究中使用这些实时图像采集和分析方法，以可视化，并在慢性青光眼和他们的关系的早期阶段跟踪动力学和视盘和视网膜小胶质细胞的变化模式来晚了神经退行性疾病59。在这里，我们示出了CSLO图像采集协议跨越大面积在个别年轻杂CX3CR1-GFP的DBA / 2J视网膜中央视网膜（ 图5）的可视化的小神经胶质细胞。基于高元分辨率，我们应用实时图像阈值和形态分析，允许单个GFP +细胞和胞体（ 图6）的自动分割。
要监视本地小神经胶质细胞和/或小胶质细胞的活化在神经退行性疾病检测前慢性青光眼这种模式时代的发展，我们在衡量个别年轻杂CX总胶质细胞密度的月变化3CR1-GFP DBA / 2J视网膜3-5个月的婴儿（ 图7A）之间（N = 10）。符合神经变性个别眼睛41-44的可变进展，我们的分析揭示了视网膜小胶质细胞的活化和小神经胶质细胞在整个眼睛的可变水平在每个年龄（ 图7B），并且检测在总的密度和动态变化个别视网膜内激活的小胶质细胞（ 图7C）。值得注意的是，小胶质细胞活化的数字从总的GFP +细胞密度并发修改脱开。这些体内的调查结果证实了先前的体外分析，小胶质细胞的变化DBA / 2J小鼠45。因此CSLO现场检测和视网膜胶质细胞活化的测定可作为个人的眼睛内的早期疾病进展的指标，且有可能被链接到启动青光眼发病的事件。
图2：实时图像采集控制在CSLO Spectralis（A）上启动手动触摸屏显示器。 （ 二）CSLO 软件成像窗口，显示活老鼠的头部。 （ 三）选择红外成像设置（蓝色亮）。 （D）中的视网膜中的实时采集（左图）和平均（右图）眼底图像。标准化的命令用黑色圆圈。动脉和静脉从视神经乳头辐射是可见的（括号之间），因为是视神经轴突束（箭头）在血管之间。在一个单一的XY点选择荧光成像（E）的设置。 （F）单点荧光（FA，488纳米）收购期间（平均）成像。 Ť他更小的图像（左）显示了单个扫描中，较大的图像（右）示出了强度平均化的进度。选择收购多点（复合），荧光图像（G）的设置。 （H）多点荧光成像采集，显示正在进行的扫描，该软件识别与绿色圆圈（或红色时，收购是不可能的）。比例尺代表〜5毫米（B）或250微米（DH） 点击此处查看该图的放大版本。 。
图3：关键眼部缺陷和成像误差，可以防止小胶质细胞的正确CSLO成像（A - C）眼部损伤或缺陷，以及图像获取错误。S能防止GFP +细胞定位于视网膜的最内面的可靠的成像。（A） 的一些毛眼缺陷是在眼底图像，包括角膜或晶状体混浊，或伤害和深化视盘面积容易检测，所有这些都防止GFP +细胞的清晰成像。 （B）的对焦或者上述（血管的壁成为从管腔难以区分）或视网膜（血管勉强可见）的内表面下降低的GFP荧光发射从细胞位于神经纤维和神经节细胞的可探测层。 （C）水平的饱和或不正确设置不均匀会导致光明的，但过饱和的图像（与缺乏分辨单元）与模糊的领域或图像。比例尺代表250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：小胶质细胞计数和常 染色体区域的二进制阈值，基于量化（A - D）在FluoRender细胞分割步骤（A）导航窗口小胶质细胞的代表性单点荧光图像的中央视网膜内渲染视图。 （上图）;对应渲染属性（下图）。 （B）一种细胞分割例程期间的相同图像，看作RGB，与相 应的阈值的设置（下面板）。阈值细胞被白色像素，并覆盖其在青色的过程。细胞分割后获得的细胞的掩模（C）的图像。 （D）上的面具进行进一步的图像处理倒灰度值。 （E - ^ h）常染色体阈值和量化的步骤。（E）的使用的强度阈值，以基于它们的先前单元分割段的小胶质细胞胞体。该RGB强度直方图（左）允许阈值直接选择低50-60％范围内强度（0至127-153）的。这种分割创建了一个可量化的面具，单独隔离小胶质细胞胞体（蓝色）。图像使用样条函数（椭圆形右）重新调整。 （F）的个体的ROI /胞体（顶部图）和用于校正使用二进制工具（右面板），用于人工分离或侵蚀重叠的ROI的ROI剪影（对象目录，底部面板）的自动基于阈值的测量结果。个人常染色体区域（G）分类的区域限制（左上图）。分段胞体被分类为感兴趣区更小和大于50-60微米2，并且为每一类胞体的二进制层被分配不同的颜色像素（绿色第二品红，分别）。在原始图像上的分割胞体（绿色）的用于单个活化细胞直接观察的过程的复杂性（左面板）（H）覆盖（具有增加对比度）。放大查看电池乔木。标尺代表250微米（AH）或50微米（H，插图）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：CX3CR1- GFP +胶质高分辨率可视/单核细胞定位于内小鼠视网膜由活共焦激光扫描成像（A）单一XY-点CSLO图像表示内的中心的GFP +细胞。视网膜中有2个月大的DBA / 2J小鼠（左）。放大图（右）显示视盘区（圈），血管（线）内衬血管周围的小胶质细胞/巨噬细胞和小胶质细胞实质的平铺视网膜中央。 （二）多点图像，立即采集单点后，小胶质细胞可视化在较宽的视网膜区域（视网膜⅓）。 （C，D）相同的图像，具有倒灰度为细胞形态和复杂性最佳观测所示（最小调整对比度和分辨率）。常染色体的尺寸和形状可以在大多数细胞（左）来解决。植树节延伸和分支的细胞可以在细胞胞体较大（右和3个体细胞）来解决。 （E）用于连续图像的XY -平面排列的血管和视盘红外眼底图像。标尺代表250微米（A，B和E）和25微米（C，右一）。ES / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图6：胶质细胞和胞体的分割（A）GFP +细胞使用FluoRender在由2D渲染的分割。 （B）相应的单元格胞体，利用共聚焦图像分析软件检测阈值。 （ 三）细胞胞体服从定量分析二进制掩码。 （D）的由区域分割细胞胞体的分类来区分活化的小神经胶质细胞（> 50-60微米2，品红）和非活化的细胞（<50微米2，绿色）。弱小细胞（<10〜20微米2，黄色星号）在与倒灰度原始图像（人工识别
图7：小神经胶质细胞密度和活化在年轻的DBA / 2J视网膜纵向跟踪 （A） 的活CSLO眼底同一只眼睛的和FA图像，从3-5个月的年龄获得。连续的FA图像被用来量化中的中央〜1.7毫米2视网膜的定位于CX3CR1-GFP的总数目+细胞随时间的变化。计数包括实质和血管周围的小胶质细胞，但不包括细胞聚集在视盘（位置标有白色圆圈）。 （B）中的视网膜小胶质细胞密度和活化在前述年龄时间过程分析神经退行性疾病中的DBA / 2J慢性青光眼（N =每10岁时视网膜）。每视网膜中央毫米2激活小神经胶质细胞（常染色体区域> 50微米2）的总GFP +细胞数量。每个数据点代表一个单一的视网膜的装置，以及为每个年龄的代表与一个水平线。活化小神经胶质细胞中的单个视网膜的总的GFP +细胞和的数字（℃）每月跟踪。总共有并激活细胞密度平行但定量地不同的变化，在形态上激活细胞的密度更动态变化。比例尺代表250微米（A）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
神经变性疾病中在线监测的小胶质细胞数目和形态的激活需要使用的非侵入性的成像方法，使细胞的功能的详细可视化。成像后，小胶质细胞，必须分离（分段），用于形态测定分析通过使用多个阈值的步骤，以评估常染色体的大小和/或过程的复杂性作为读数为小胶质细胞活化。在这个协议中，我们描述了使用CSLO实时图像采集，和小胶质细胞活化的基于序列的细胞和胞体分割的定量分析方法。我们将这些策略，以评估视网膜的小胶质细胞活化和小神经胶质细胞的动力学超过2个月，在视网膜的慢性神经变性疾病的情况下。
记者小鼠和小胶质细胞/单核细胞周围的细胞类型
使用表达该fractalkine的受体的控制下的GFP小鼠（CX3CR1）轨迹46允许可靠识别驻地小胶质细胞，和强大的GFP表达显着允许在体内可视化30-32,34,36。这里，我们使用一个亚株的DBA / 2J小鼠，通过回交C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J小鼠46到DBA / 2J遗传背景59而得。外围单核细胞和巨噬细胞，疾病或损伤时可侵入中枢神经系统，也表达绿色荧光蛋白标记15,46,47。
小胶质细胞在神经退行性视网膜实时成像研究
我们的体内跟踪使用CSLO CX3CR1-GFP / +视网膜细胞的建立在先前的研究，监测急性损伤为10周30-32,34,48在视网膜的GFP +细胞数的变化。在这里，我们可视化CX3CR1-GFP / +小胶质细胞/单核细胞周围慢性青光眼的早期发展过程中的细胞决议，视网膜每月CSLO成像。一个dditionally，我们使用实时图像的自动阈为基础的分析来检测和量化细胞调整大小并具有足够的空间和时间分辨率重塑并监控变化中的各个眼睛和整个个人激活和总的小胶质细胞计数。
GFP +小胶质细胞成像CSLO在视网膜技术限制
我们发现的成像质量是一致的和可重复的，就说明了单对（ 图5）在一个会议上获得多点的XY图像的对比。然而，一致和可重复的GFP +细胞成像采集，在单个会话中和随着时间的推移，是关键取决于稳定参数对眼底和荧光CSLO成像选择。眼睛和视盘的CSLO目标对准确定饱和度的均匀性和聚焦于感兴趣49共聚焦平面。不准确和/或不均匀的specificati关于饱和度的可产生在GFP的检测，自体荧光背景，以及细胞和乔木分辨率人为的变异。为了正确地集中在小胶质细胞定位于神经纤维和神经节细胞层，关键是要对准和聚焦在视网膜血管和轴突束在通过IR眼底成象玻璃体表面。这提供了一个参考平面来定位的GFP +细胞的FA。需要从红外切换到FA的要求重新调整可通过收购多个FA在图像略有不同深度（55-60 D）在每个实验性会议的指导。这也可以帮助弥补因年龄，瞳孔扩大和病理学（视盘挖掘）解剖学差异。由于图像分辨率和细胞细节取决于饱和度的最佳规格整个眼底，以及相对于相机49的眼睛的仔细对准，取得随 时间图像序列为同一眼睛必须显示眼底红外图像采用consistent和可比的焦点，照明，分辨率和视网膜领域跨度。总的GFP +细胞数在单个会话（1.5-1.7毫米2视网膜中，n = 13的视网膜，年龄3-5个月）获得的图像手动计数证实细胞构成（3-4％的 变化的一致性和可重复性进行定量;数据未示出）。这是必要的图像，其将适合于通过基于类似的强度范围的阈值分析，并随时间的变化进行比较的GFP +细胞的分割。
视网膜小胶质细胞在活CSLO图像阈值和形态分析
只是在最近， 在体内的可视化脑小胶质细胞与由双光子共聚焦显微镜高蜂窝分辨率已使小胶质细胞胞体和工艺参数的定量分析，以及形态活化的小胶质9,50的鉴别。如图所示这些作者，常染色体的大小是最引人注目的形态参数检测随着时间的推移由脑小胶质细胞，用迭代基于强度的阈值的实时双光子共焦成像，以减少信号噪声变化9。此外，常染色体大小的变化与相关的表达Iba1上调活化细胞9。这里，我们使用CSLO现场图像和应用小神经胶质细胞和胞体，随后形态学分析来定量总的数量的可比顺序分割和激活定位于视网膜CX3CR1-GFP +细胞。
我们使用专门共焦渲染软件（FluoRender）到段的GFP +细胞在中心视网膜。这些图像，被进一步阈值采用市售的共焦图像分析软件包，以最终允许自动分割和常染色体区域的基于阈值的量化。我们的实时图像分析证实使用SOMA尺寸为胶质细胞活化的实时图像分析9形态的度量。常染色体基于阈值的计数允许的图案和增加视网膜小神经胶质细胞的表征，如先前通过体外图像分析50证实。我们发现，CSLO检测的GFP +胶质用鼠标中央视网膜（<2平方毫米 ），其中细胞可在同一共焦平面被成像内的最佳分辨率和细节。朝视网膜外围，荧光信号表明变性和扭曲现象防止相同的成像处理和阈值分析作为在更平坦中心视网膜检测的GFP +细胞。最后，我们的协议表明CSLO 体内图像视网膜小胶质细胞的分析提供了一个相对高的吞吐量。实质小胶质细胞的数量，可以在视觉上分离的和中心视网膜内量化变化之间〜200-300细胞总数，和〜10-180活化细胞。因此，鼠标视网膜胶质细胞提供了一个最佳的人口研究在体内转化自己和角色ðuring神经变性的发病有关。
适用于其他中枢神经系统慢性疾病
这里所描述的体内图像分析方法应适用于评估在其他小鼠视网膜疾病和损伤模型的急性或慢性神经胶质的变化。此外，该协议可以用于评估来自慢性CNS病症，如阿尔茨海默氏症，帕金森病和多发性硬化导致的视网膜小胶质细胞/外周血单核细胞的改变，因为视网膜和视神经在这些疾病51-56针对神经变性。本着这一精神，利用现场检测视网膜和视盘病理的早期阿尔茨海默病管理是在紧张的学习54,57,58。
总之，我们的研究结果表明，现场，纵向跟踪和改变视网膜小胶质细胞数量和形态激活量化，可以作为可靠的NEuroimaging生物标志物检测疾病发作和早期发展。这些体内成像和分析方法适用于年龄相关性青光眼，并有可能对其他神经退行性疾病，影响视网膜和视神经。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
References
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A.
- Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
- Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
- Jacobs, A. H., Tavitian, B.
- Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
- Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
- Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A.
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
- Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
- Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
- Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
- Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
- Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
- Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
- Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
- Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
- Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
- Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
- Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
- Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
- Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
- Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
- Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
- Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
- Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
- Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
- Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
- Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
- Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
- Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
- Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
- Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).
