Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.
Introduction
NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark 1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel 2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks 5,6.
Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss 2 entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals 6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender 10 isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
Referências
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