Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Yetişkin sıçan ve büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir ortam içinde kültürlenmiş insan omurilik sinir kök / progenitör hücreleri (NSPCs) kendini yenileyen ve genişletilebilir nöral kök hücre multipotent çoğalması için izin verir. Serum koşullarda, bu multipotent NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrositleri üreten, ayırt edecektir. Hasat doku bFGF (enzimatik olarak papain EDTA çözeltisi içinde çözülmüş ve daha sonra mekanik olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş Neurobasal orta, temel fibroblast büyüme faktörü olduğu için kaplama, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ayrılmış ve kesintili bir yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılır ) ve heparin. Yetişkin sıçan omurilik NSPCs yapışkan kültürler olarak büyütülür serbest yüzen neurospheres ve yetişkin insan omurilik NSPCs olarak kültürlenir. Bu koşullar altında, yetişkin omurilik NSPCs ön-madde hücreleri ifade belirteçleri, çoğalırlar ve sürekli geçmesi üzerine genişletilebilir. Bu hücreler olabilir bE, çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak, in vitro incelenmiştir ve dış faktörlerin nöral kök hücre farklılaşması incelemek için soy kısıtlama teşvik etmek için kullanılabilir. Multipotent NSPCs veya onların soyu rejeneratif onarım değerlendirmek için çeşitli hayvan modellerinde transplante edilebilir.
Introduction
NSPCs kendini yenilemek ve kolayca in vitro genişletebilirsiniz sinir soyu taahhüt multipotent hücrelerdir. Onlar kendini sürekli yenileyen multipotent kök hücreleri ve daha kısıtlı atalarıdır özelliklerini görüntülemek beri nöral kök / progenitör hücrelerin karışık bir nüfus olarak bu hücrelerin bakın. NSPCs fetus ve erişkin beyin ve omurilik 1,2 hem de bulunabilir. Yetişkin olarak, NSPCs normalde sakin ve yan ventriküller 2-4 astar subventriküler bölge ve spinal kord 5,6 merkez kanal çevreleyen periventriküler bölge de dahil olmak üzere belirli niş içinde bulunur.
Tipik haliyle, NSPCs EGF ve bFGF ile takviye edilmiş serumsuz ortam içinde serbest yüzen neurospheres ya da yapışık mono tabakaları, kök / progenitör hücre popülasyonları için seçin Mitojenler gibi kültürlenmiştir. Başlangıçta Reynolds ve Weiss 2 tarafından geliştirilen neurosphere deneyi, en yaygın olarak kültürlemek için kullanılan vesinir kök hücreleri genişletin. Bunlar büyüme faktörü içermeyen ortam serum içeren kaplama olduğunda NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrosit ayırma yöntemi, multipotency göstermektedir. Kültürlü doku, merkezi kanal 6,7 bölgeleri içerdiğinde Multipotent, kendini yenileyen NSPCs yetişkin kemirgenden omurilik izole edilmiş ve kültürlenmiş edilebilir. Diğer bölgelerden gelen hücrelerin üretilmesi aksine yetişkin omurilikten kaynaklanan NSPCs kullanarak potansiyel avantajı, bu dokuya spesifik hücrelerin en yakın yaralanma ya da hastalık şu kayıp ya da hasarlı olan omurilik hücreleri benzer olmasıdır.
Önceki çalışma yetişkin insan omurilik türetilmiş neurospheres uzun vadeli yayılır veya hücre 8,9 yeterli sayıda üretmek için geçişli olamazdı gösterdi. Ancak, kültür koşullarında değişikliklerle, biz göstererek, yetişkin insan omurilik kökenli NSPCs genişletilmesi ve nakli bildirdi kendini sürekli yenileyenve multipotent NSPCs, organ nakli donörlerinin 10 yetişkin insan omurilik izole edilebilir. Öncelikle, büyüme faktörü açısından zenginleştirilmiş bir ortam içinde bir alt-tabaka üzerine yapışık diseksiyon ve bu hücrelerin kültür içinde beyaz bir maddenin en çıkarılması, yetişkin insan omurilik NSPCs çoğalan için seçildi. Bu protokolde, yetişkin sıçan ve insan organ nakli donör, periventriküler doku diseksiyonu ve NSPCs izolasyonu, kültür ve genişlemesi omurilik hasat açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıçan omurilik dokusu bakım diseksiyonu sırasında laminektomi yaparken omurilik zarar vermemek için dikkat edilmelidir. Bu omurilik segmentleri sağlam olduğunda periventriküler doku izole etmek daha kolaydır. Doku parçaları tam olarak tahlil tamponuna daldırılmalıdır ve örten zarları ve beyaz madde microscissors boyuna şeritler gibi kesilebilir. Alternatif olarak, ince doku forseps uzakta beyaz cevher soymak için kullanılabilir.
NSPCs için izolasyon prosedürü için, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
Referências
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
