Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52734
Automatic Translation
1,2, 1, 4, 1,2,3, 1
1Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, 3Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, 4Blood Research Institute of Wisconsin

Abstract

الكالسيوم هو منظم هام جدا من العديد من العمليات الفسيولوجية في الأنسجة الوعائية. معظم البطانية والعضلات الملساء وظائف تعتمد إلى حد كبير على التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ([كا 2+] ط) وأكسيد النيتريك (NO). من أجل فهم كيف [كا 2+] ط، NO ويتم التعامل مع جزيئات المصب بواسطة أحد الأوعية الدموية في استجابة لvasoconstrictors وموسعات، قمنا بتطوير تقنية جديدة أن ينطبق الكالسيوم وضع العلامات (أو NO-التوسيم) الأصباغ مع اثنين من الفوتون المجهري لقياس التعامل مع الكالسيوم (أو أي إنتاج) في الأوعية الدموية معزولة. وصف هنا هو خطوة بخطوة الإجراء الموضح الذي يوضح كيفية عزل والشريان الأورطي من الفئران، الكالسيوم التسمية أو NO داخل الخلايا البطانية أو العضلات الملساء، وصورة العابرين الكالسيوم (أو NO الإنتاج) باستخدام مجهر اثنين من الفوتون التالية الفسيولوجية أو المنبهات الدوائية. فوائد استخدام طريقة هي متعددة جوانب: 1) أنه من الممكن في وقت واحدلاي قياس العابرين الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في استجابة للمؤثرات مختلفة؛ 2) أنه يسمح احد لخلايا صورة البطانية وخلايا العضلات الملساء في بيئتها. 3) هذه الطريقة هي حساسة جدا للكالسيوم داخل الخلايا أو NO التغييرات ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. و4) نهج صفها يمكن تطبيقها على قياس الجزيئات الأخرى، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية. باختصار، تطبيق اثنين من الفوتون المجهري انبعاث الليزر لمراقبة العابرين الكالسيوم وNO الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية ومعزولة قدمت بيانات كمية عالية الجودة والترويج فهمنا للآليات تنظيم وظيفة الأوعية الدموية.

Introduction

الكالسيوم هو رسول الثاني الأساسي داخل الخلايا الوعائية مثل البطانية وخلايا العضلات الملساء. هو الحافز الأساسي لتقلص الأوعية الدموية، ويلعب دورا رئيسيا في توسع الأوعية الدموية، بما في ذلك آثاره من خلال NO جيل داخل البطانة. بسبب القيود المفروضة على تقنيات التصوير، فقد كان من المستحيل تقريبا لمراقبة التعامل مع الكالسيوم داخل السفينة سليمة. تطوير نظامين التصوير فوتون وإنشاء الكالسيوم جديد أو NO الأصباغ وضع العلامات، ويجعل من الممكن لصورة على عمق ودقة كافية للبدء في فهم ديناميات الكالسيوم وNO الإنتاج داخل الأوعية الدموية.

وقد تم مؤخرا تطبيق اثنين من الفوتون المجهري في الأنسجة والأجهزة والدراسات على الحيوانات حتى بأكملها بسبب القدرة الفائقة لاختراق عميق الأنسجة مع انخفاض مضان الخلفية وحساسية إشارة عالية 1،2 الطيف ضيق اثنين من الفوتون الإثارة في illuminatأيون نقطة اتصال واستخدام أجهزة كشف غير descanned هي الأسباب التي دفعت اثنين من الفوتون المجهري متفوقة على المجهر متحد البؤر التقليدية. المجهر متحد البؤر لا يمكن أن تنتج صورا ذات جودة عالية في عمق الأنسجة ضروري نظرا لصناعة السيارات في مضان ونثر من خارج التركيز الضوء في الثقب متحد البؤر. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير طريقة استخدام المجهر اثنين الفوتون لقياس [كا 2+] ط الإشارات وNO الإنتاج في حالها، الفردية خلايا الأوعية الدموية مع ارتفاع القرار، ونسبة منخفضة إشارة إلى الضجيج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية الطب في ويسكونسن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. عزل الجرذ الأبهر

  1. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) أو IACUC آخر وافق الأسلوب.
  2. وضع الفئران في موقف ضعيف. من أجل فضح أعضاء البطن، وجعل شق خط الوسط بطني صغير من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن. باستخدام قطع من الشاش يصرف بلطف الأمعاء لفضح الشريان الأبهر والوريد الأجوف كما هو مبين في الشكل 1.
  3. لفترة وجيزة، بلانت تشريح الشريان الأورطي من النسيج الضام ومن الوريد الأجوف. باستخدام خياطة وربطة عنق من الشريان الأورطي في أقرب وقت ممكن إلى الكلى. تشريح حوالي 1-2 سم من الشريان الأورطي ووضعه في المخروطية 15 مل توتكون تحتوي على فسيولوجية طبيعية محلول الملح (PSS، في ملي: 140 كلوريد الصوديوم، 1.2 MgCl 2، 2 CaCl 2، 4.5 بوكل، 6 الجلوكوز، 10 HEPES) على الجليد.
  4. مرة واحدة يتم عزل الشريان الأورطي، الموت ببطء الحيوانية وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع عدم بقاء الإجراءات الموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان. 3
  5. باستخدام مجهر التشريح، وملقط غرامة ذات الرؤوس، وmicroscissors تشريح الدهون والنسيج الضام الخروج من الشريان الأورطي. مرة واحدة في الشريان الأورطي نظيفة، وقطع الشريان الأورطي طوليا ووضعه في جهاز الأمن الوقائي على الجليد في وقت لاحق.

2. صبغ التحميل والحضانة

  1. الماصة 7 ميكرولتر من 1 ملم فلوو-04:00 صبغ، الذي تم توفيره في حل يستند إلى DMSO، إلى الفردية 500 أنابيب ميكرولتر التي تم تغطيتها بورق الألمنيوم. تخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 مئوية إلى الحفاظ على خصائص الصبغة مع مرور الوقت. ملاحظة: هذه aliquoted ذلكوينبغي أن يكون lutions مستقرة لمدة ستة أشهر على الأقل.
  2. قبل الاستخدام، والسماح للحلول صبغ في عملية الاحماء لRT قبل الافتتاح. إعداد حلول العمل فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين كاشف المخفف لاستخدامها لاحقا.
  3. إضافة 7 ميكرولتر من الجاهزة 1 ملم فلوو-04:00 الذائبة في حل DMSO إلى 450 من المجاهدين PSS لا تحتوي على الكالسيوم صبغ. إضافة 40 ميكرولتر من غير DMSO أساس 10٪ حمض Pluronic حل للكوكتيل تحميل للمساعدة في تفريق acetoxymethyl (AM) استرات وتحسين التحميل من الصبغة الكالسيوم.
  4. وضع aortas تشريح في 500 ميكرولتر أنابيب تحتوي على كوكتيل تحميل (كما هو موضح في 2.3) لمدة 1 ساعة. تغطية جميع أنابيب مع احباط ومكان على شاكر الدورية في RT.
  5. لرصد أي إنتاج في الأوعية الدموية، واستخدام DAF-FM ثنائي الأسيتات الصبغة. احتضان الشريان الأورطي في محلول يحتوي على 450 ميكرولتر PSS، 40 ميكرولتر حمض pluronic و 5 ميكرولتر من 10 ملي ثنائي الأسيتات DAF-FM. وعلى غرار بروتوكول حضانة الكالسيوم (موضح في 2.3)، ضع الشريان الأورطيفي أنبوب 500 ميكرولتر التي تحتوي على حل NO-صبغ المشمولة في احباط ومكان على شاكر الدورية لمدة 30 دقيقة على 4 ج تليها 30 دقيقة المقبل في RT.
  6. عندما يتم قياس NO الإنتاج، واستخدام البطانية NO سينسيز مانع، L-NAME، لمنع أي إنتاج كعنصر تحكم كما هو مبين في الشكل 4B. لهذا الإجراء، إضافة إلى كوكتيل (كما هو موضح في 2.5) 100 نانومتر L-NAME لمدة 30 دقيقة الأخيرة من الحضانة (في RT).

3. بروتوكول الفوتون المجهري بالليزر الضوئي الثاني

  1. بعد 1 ساعة الحضانة، وغسل الشريان الأورطي 2-3 مرات في نظيفة PSS لإزالة الصبغة خارج الخلية.
  2. نقل الشريان الأورطي إلى طبق المغلفة السيليكون التي تحتوي إما PSS العادي أو الكالسيوم 2+ عازلة خالية (يعتمد على بروتوكول تجريبي). دبوس الشريان الأبهر أسفل على طلاء السيليكون مع البرانية في اتصال مع سيليكون (أي التجويف البطانية تتعرض لافتتاح الطبق) باستخدام دبابيس على شكل μ. بدلا من ذلك، استخدم شريحة مرساةالشبكة أو الغراء لإصلاح الأنسجة.
    ملاحظة: للحد من التوتر والتحف الميكانيكية المحتملة ونقل وإصلاح الشريان الأورطي في كا 2+ خالية من الحل والانتظار 5-10 دقيقة قبل بدء التجربة.
  3. توصيل مضخة تحوي أو حقنة لوحة المغلفة للسيليكون التطبيق التلقائي أو اليدوي للمخدرات أو لتغيير حل خارج الخلية.
  4. وضع طبق تحت قطعة أنف مستقيم المجهر ثنائي الفوتون، وتركيب ووضع 25 × (NA 1.05 والعمل عن بعد 2 ملم) الغمر بالمياه العدسة الشيئية فوق العينة. ملاحظة: إذا كانت هذه عدسة معينة غير متوفرة، استخدم الهدف صنعت خصيصا لمدة تصوير الفوتون، لأنه يمكن زيادة دقة إشارة بشكل كبير مقارنة مع هدف منتظم.
  5. تفعيل الليزر اثنين الفوتون باستخدام برنامج (ليزر يبدأ في ضخ وتشغيل). ضبط الإثارة ليزر 820 نانومتر.
  6. استخدام epifluorescence، موقع الشريان الأورطي والتركيز على الهدفسطح البطانية باستخدام التعديل الخشنة.
  7. التبديل المجهر إلى قسمين الفوتون وضع المسح الضوئي ليزر، وضمان أن الليزر الإثارة ووضع مقفلة، وتشارك في كشف غير descanned ويتم تثبيت المرشحات الانبعاثات المناسبة لأطياف الانبعاثات المتوقعة. ملاحظة: وهنا استخدمت FV10-MRL / R (495-540 نانومتر).
  8. بدء المسح الضوئي المباشر باستخدام ما يقرب من 5٪ قوة الليزر والتركيز بدقة على الهدف من أجل رؤية الخلايا البطانية.
    ملاحظة: الخلايا البطانية سوف تظهر إشارة الفلورسنت قوية عندما حضنت في PSS العادي. وسيكون هذا أضعف بشكل ملحوظ عندما يتم تحضين السفن في المخزن خالية من الكالسيوم. الخلايا البطانية سوف تكون موجودة على الجزء العلوي من الشريان الأورطي فتح ويمكن رؤية خلايا العضلات الملساء فقط دون الخلايا البطانية (انظر الشكل 2). لأن الأوعية الدموية ليست سلسة ولا حتى، سيكون هناك أماكن حيث كل من خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية موجودة. </ لى>
  9. مرة واحدة كانت الخلايا في التركيز، برنامج البرنامج المجهر لجمع صور متسلسلة في وضع المسح الضوئي السريع (النقطية المسح، 512 X 512 بكسل نافذة مع تواتر جمع اطار 1،1 ق). بالتوازي مع فلوو-04:00 مضان، وجمع الصور المنقولة الخفيفة من أجل الكشف عن التغيرات في انكماش الأوعية وأفضل تصور الظروف التجريبية.
  10. بعد مجموعة من الصور إشارة مرجعية، تغيير تركيز أيون الكالسيوم 2+ في حل خارجي أو ببطء تطبيق عوامل التحفيز الدوائي باستخدام مضخة تحوي بينما التصوير. نلاحظ الزيادة إشارة الفلورسنت داخل خلايا تحميل.
    ملاحظة: الخلايا البطانية تستجيب للتغيرات في التدفق، وبالتالي فمن المستحسن أن تستخدم تطبيقات الصفحي المنخفضة واختبار السيارة قبل تطبيق المنشطات الدوائية من الكالسيوم 2+ أو NO الإشارات. لحساب الكالسيوم داخل الخلايا لنانومتر قيم تركيز في سفن محملة فلوو-4 (ثابت التفكك لفلوو-4 طالصورة 345 نانومتر)، يمكن أن تسجل كثافة مضان في الأساس وبعد إضافة ionomycin وMnCl 2. 4

4. معالجة الصور والحسابات

  1. تحميل وتثبيت حزمة فيجي معالجة الصور.
  2. فتح ملف الصورة في فيجي. عند استيراد ملف، وتقسيم قنوات (الضوء المرسل وإشارة الفلورسنت) عند المطالبة. استخدام فقط في إشارة الفلورسنت لتحليل البيانات.
  3. ضمن برنامج فيجي، انقر فوق علامة التبويب تحليل وانزل الى خيار الأدوات. تحت خيار الأدوات، والعثور على علامة التبويب التي يقول مدير ROI واضغط عليها. ستظهر نافذة جديدة.
  4. بعد ذلك، انقر على القياسات مجموعة تحت علامة التبويب تحليل. حدد مقاييس محددة من الفائدة. للقياسات عابرة الكالسيوم، استخدم خيار القيمة الرمادي يعني.
  5. مع أداة التتبع دائرية، والبدء في تتبع المناطق ذات الاهتمام (ROI) وانقر على زر "إضافة" على الشاشة مدير ROI لكل ROI. مرة واحدة وقد تم تتبع جميع الخلايا في المصالح، في إطار إدارة ROI، حدد متعددة التدبير تحت عنوان "أكثر" علامة التبويب. تذكر أن إما حفظ قياسات مباشرة أو نسخ ولصق كل هذه القياسات في جدول بيانات.
  6. * فتح ملف txt أو جداول البيانات إكسل من فيجي ونقل الأرقام إلى ورقة عمل جديدة المنشأ. ملاحظة: يمكنك أيضا استخدام أي برنامج مثل سيغما قطعة أرض أو بريزم لمزيد من التحليل.
  7. ضمن برنامج المنشأ، استخدم قطعة أرض → القائمة الخط + رمز لمراقبة لمحة عامة عن جميع الردود عابرة. إلغاء الخلايا لا تستجيب.
  8. حساب عدد تتبع لنطاق الوقت (X محور)، استخدم العمود → تعيين قيم العمود والعمود مضاعفة عدد تتبع لتواتر جمع الصور (في حالتنا 1.1s).
  9. استخدام التحليل → إحصاءات عن صفوف لجميع التسجيلات المختارة لحساب متوسط ​​(المحور Y) وأثر خطأ قياسي. رسم الرسم البياني النهائي للمجموعة الحالية من خلايا مؤامرة → الخط + رمز.
  10. الشرق الأوسط وأفريقيان يوصف الكالسيوم حساب عابرة على النحو التالي.
    1. لمجموع الافراج عن الكالسيوم في إطار البرنامج المنشأ، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة تحليل → → دمج حساب التفاضل والتكامل. يبدو جزءا لا يتجزأ الكلي للمنطقة تحت منحنى في النتيجة السجل.
    2. لحركية عابرة، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة: المنحنى تحليل → غير الخطية صالح → حدد مجموعة البيانات (اختر تتراوح محور X من الحد الأقصى لوضع حد للاستجابة عابرة). بدء تركيب → حدد وظيفة → الأسي تسوس 1 → القيام به.
      ملاحظة: يظهر المناسب الأسي في الرسم البياني النافذة والنتيجة السجل. البيانات التي تم الحصول عليها (القيم) تمثل المبلغ الإجمالي للكالسيوم المفرج عنهم، وحركية القنوات بوساطة الاستجابة العابرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل إجراء تقييم دقيق للمساهمة الكالسيوم لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية (توسع الأوعية وتضيق الأوعية)، وقد تم تصميم بروتوكول لتحميل الأصباغ الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأبهر سليمة معزولة. التجريبية العامة إعداد مبين في الشكل 1، يبين الاستراتيجية الأساسية لعزل وإعداد السفينة قبل التصوير. لفترة وجيزة، بعد عزل الشريان الأورطي من الفئران، ينبغي تنظيفها من الدهون والنسيج الضام وشق طولي. ثم ينبغي أن توضع في الشريان الأورطي فتح في المغطاة احباط 500 ميكرولتر الأنبوب الذي يحتوي على استعداد كوكتيل تحميل مسبق كما هو موضح في البروتوكول وحضنت في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز الضوء. بعد الحضانة، يجب غسلها الشريان الأورطي، تمركزها على طبق من ذهب المغطاة سيليكون مع البرانية أقرب السيليكون والتجويف صعودا، وتحويلها إلى تستقيم المجهر اثنين الفوتون للتصوير.

انسه تم وضع الأبهر على المجهر والسفينة هو في التركيز، وينبغي أن تكون الخلايا البطانية السهل العثور من قبل القوي الانبعاثات فلوري (الشكل 2A). فإن الخلايا البطانية أيضا يكون الهدف الأول ليدخل حيز التركيز لأن التجويف السفينة، التي تتكون أساسا من الخلايا البطانية، يجب أن تواجه التصاعدي عندما علقت السفينة إلى أسفل. بالإضافة إلى تصوير الخلايا البطانية، سيكون هناك المواقع التي خلايا العضلات الملساء مرئية (الشكل 2B). وهكذا كل من البطانية وخلايا العضلات الملساء يمكن تحديد داخل نفس المجال التصوير (الشكل 2C). يمكن لديها القدرة على أنواع الخلايا الوعائية صورة داخل مجال التصوير نفسه يؤدي إلى فهم أفضل لكيفية هذه الخلايا معا، ولكن بشكل مستقل، وتستجيب للمنبهات ومحفزات مختلفة.

للتدليل على فائدة هذه الطريقة، والقياسات من خلايا الشريان الأورطي الاستجابة لإضافةcetylcholine (ACH)، وموسعة وقوية على وجه التحديد التي تسبب تغيرات داخل البطانة، تم تحديد. كما هو مبين في الشكل 3A، والخلايا البطانية يمكن رؤيتها بسهولة في حين المحتضنة في PSS العادي. بعد إضافة أدن تشافيز (الشكل 3B)، والبطانية زيادات مضان الخلية تشير إلى أن محتوى الكالسيوم داخل الخلايا في تزايد أيضا. الكمي لمضان المنبعثة من رويس، أو الخلايا البطانية، هو مبين في الشكل 3C. بعد إضافة أدن تشافيز، ويزيد محتوى الكالسيوم داخل الخلايا بإرجاع بسرعة ثم ببطء مرة أخرى إلى خط الأساس. الزيادة في الكالسيوم داخل الخلايا البطانية في الاستجابة لأدن تشافيز تتفق مع التقارير السابقة. 5،6

على غرار الدراسات الكالسيوم، وهذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن البطانية NO الإنتاج. لهذه التجارب، تم تحميلها الخلايا البطانية الأورطي مع DAF-FM ثنائي الأسيتات صبغ كما هو موضح فيالشكل 4A. واستخدم هذا النهج في الآونة الأخيرة لإثبات أن NO زيادة الإنتاج في كاليفورنيا 2+ بطريقة معتمد على ردا على التحفيز أدن تشافيز. 6 الأهم من ذلك، بعد العلاج مع L-NAME، وهو البطانية NO المانع سينسيز، تم حجب هذا الرد (الشكل 4B).

وأظهرت آخر مثال ممثل كيف يمكن تطبيق هذه التقنية لقياس الكالسيوم داخل الخلايا في فيديو 1، حيث تم إضافة الحل التي تحتوي على الكالسيوم إلى السفينة التي تم المحتضنة في المخزن الكالسيوم مجانا. عندما يتم تحضين الشريان الأورطي في البداية في المنطقة العازلة الكالسيوم الحرة (في بداية الفيديو)، والخلايا البطانية هي الفلورسنت ضعيفة تشير إلى انخفاض مستويات الكالسيوم في الخلايا. ومع ذلك، بعد إضافة PSS العادي، والخلايا تستجيب على الفور عن طريق زيادة [كا 2+] تركيز الأول والتي ينبعث منها ارتفاع كثافة مضان. وتظهر هذه التجربة أن الخلايا على قيد الحياة واستجابة للمؤثرات الخارجية. هذه التجربة أيضا بالتحقق من جدوى هذا الأسلوب مع العائد للبيانات ذات جودة عالية.

الشكل 1
الشكل 1. الأورطي عزل والتجريبية اقامة. 1) بعد التخدير الفئران، إجراء شق في البطن وعزل الشريان الأورطي من النسيج الضام، والوريد الأجوف. 2) بعد استخراج الشريان الأورطي، وتنظيف السفينة من الأنسجة الدهنية والضام وفتح السفينة عن طريق قطع طولي. 3) احتضان السفينة في فلوو-04:00 الصبغة لمدة 1 ساعة على RT مع هزاز طفيف. 4) بعد الحضانة، وغسل الشريان الأورطي، يعلقون عليه على طبق من ذهب المغلفة سيليكون، التجويف تواجه صعودا، ونقلها إلى مرحلة مجهر ثنائي الفوتون في وضع مستقيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. التصوير العضلات الملساء والخلايا البطانية بعد تحميل كافية من الكالسيوم صبغ، فمن الممكن أن صورة كل من خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية. (A) الأعلى، هو مثال على فلوو 4 مضان من الخلايا البطانية في الشريان الأورطي الفئران المعزولة. أسفل، يتم دمج صورة الفلورسنت مع وجهة نظر الضوء المرسل (مشابه لB و C). (B)، هو مثال على فلوو 4 مضان من خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي الفئران المعزولة. (C) وذلك بسبب سماكة غير موحدة من الشريان الأورطي، فمن الممكن أيضا إلى مناطق صورة على حد سواء حيث العضلات الملساء والخلايا البطانية موجودة. على نطاق وترد القضبان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر منهذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. قياس العابرون الكالسيوم في الخلايا البطانية في الاستجابة لأدن تشافيز. (A) وقد أعد الشريان الأورطي في البداية والمحتضنة في المخزن PSS العادي للتسجيلات خط الأساس. (B) بعد إضافة أستيل كولين (ACH)، إشارة الفلورسنت المنبعثة من الخلايا البطانية (رويس) تعزيز تشير إلى زيادة مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. ويظهر شريط النطاق. (C) والعابرين الكالسيوم من الخلايا البطانية ردا على منظمة العمل ضد الجوع والمحسوبة باستخدام البرمجيات المنشأ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4الشكل 4. التصوير اكسيد النيتريك في الخلايا البطانية. (A) بعد تحميل الشريان الأورطي مع ثنائي الأسيتات صبغ DAF-FM ووضعه على المسرح المجهر الفوتون اثنين، فمن الممكن أن صورة NO المستويات داخل الخلايا البطانية باستخدام مضان المنبعثة. (B) بعد الحضانة مع البطانية NO سينسيز المانع، L-NAME، انخفض مضان العام داخل رويس، مشيرا إلى انخفاض مستويات NO داخل الخلايا. على نطاق ويظهر شريط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1
فيديو 1. مثال على البطانية الاستجابة للتغيرات في الخلية الكالسيوم Concentratioن. وبعد إعداد والحضانة في فلوو-04:00 صبغ، وجرفت الشريان الأورطي مع عازلة خالية من الكالسيوم ووضعها على مسرح المجهر اثنين من الفوتون. عندما يتم وضع الوعاء في المنطقة العازلة خالية من الكالسيوم، فإن معظم الخلايا البطانية هي فلوري ضعيفة. بعد إضافة PSS العادي، والخلايا البطانية تستجيب عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا والتي ينبعث منها إشارة قوية الفلورسنت.

فيديو 2
فيديو 2. مثال على NO الإنتاج في الخلايا البطانية من isoltated الشريان الأورطي الفئران. وبعد إعداد والحضانة في DAF-FM ثنائي الأسيتات صبغ، وضعت الشريان الأورطي على مسرح المجهر اثنين من الفوتون. بعد إضافة منظمة العمل ضد الجوع في لحل حمام، والخلايا البطانية تستجيب عن طريق زيادة الخلايا Nإنتاج O والتي ينبعث منها إشارة قوية الفلورسنت. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرة عامة التجريبية. لفهم أفضل للمساهمة الكالسيوم وNO لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية، وقد تم تطوير طريقة جديدة لقياس [كا 2+] أنا وNO داخل العضلات الملساء والخلايا البطانية من aortas سليمة معزولة. معا، ويتكون هذا البروتوكول من هذه الخطوات الحاسمة: 1) عزل الميكانيكية وإعداد (الهضم الأنزيمي لا) للسفينة. فمن المهم للحفاظ على الأنسجة السليمة وسليمة قدر الإمكان للحصول على تسجيلات الفسيولوجية الأمثل. 2) الحضانة في الصبغة الكالسيوم وضع العلامات أو NO-وضع العلامات صبغ مع حمض pluronic أمر بالغ الأهمية، ولكن لبعض أنواع السفن الأخرى، قد تحتاج إلى حامض وحضانة pluronic زمنية مختلفة لفحصها. وسوف 3) تثبيت السليم من الشريان الأورطي إلى الطبق المغلفة سيليكون مع الشبكة ودبابيس تقديم نظرة مستقرة أثناء التصوير مع المجهر اثنين من الفوتون. بدعوى أن السفينة سوف انقباض وتمدد، من المهم للتأكد من أن السفينة propeالثابتة RLY إلى الطبق لتجنب القطع الأثرية الحركة التي قد تنشأ. 4) الكمي للنتائج. يرجى ملاحظة أن السعة عابرة قد لا تكون دائما أفضل معلمة لمقارنة الخصائص الفسيولوجية للخلايا. تكامل للعابرة قد تظهر فرقا أفضل نتيجة لمجموع [كا 2+] ط أو NO الافراج عنهم.

عندما يتم تنفيذ التجارب بشكل صحيح، فمن الممكن لمراقبة [كا 2+] ط (أو NO المستويات) التغيرات في الاستجابة للمؤثرات كما هو موضح في أرقام 3 و 4 و فيديو 1 و 2، ومزيج من إعداد المجراة سابقا و استخدام اثنين من الفوتون التصوير يمكن أن توفر القرار إشارة أفضل وقياسات دقيقة لعمليات الخلايا في أنسجة الأوعية الدموية. هنا، تم تطبيق هذه التقنيات في تركيبة مع الكلاسيكية غير ratiometric الكالسيوم 2+ وNO المؤشرات (فلوو-04:00 وDAF-FM ثنائي الأسيتات، على التوالي)، لقياس العابرين الكالسيوم وNO الإنتاج في الخلايا الفردية من الشريان الأورطي كله معزولة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية ستساعد على توجيه معرفتنا حول تنظيم آليات [كا 2+] أنا وNO المستويات داخل أنواع مختلفة من الخلايا الوعائية.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. نشرت المبادئ الأساسية لقياس الكالسيوم 2+ يشير في خلايا العضلات الملساء واحدة مع ionophores الحساسة في البداية في عام 1985. 7 معظم الطرق الحديثة لتصوير الكالسيوم 2+ المستويات في خلايا الأوعية الدموية الفردية قد استخدمت ليزر المسح المجهر متحد البؤر ومعزولة أو الاستعدادات مثقف. لأنسجة حيوية مثل الأوعية الدموية، فإنه من الصعب قياس الكالسيوم أو NO المستويات في الجسم الحي باستخدام التقنيات المعتمدة المجهري. 2 القيد الرئيسي هنا هو أن جميع الأوعية الدموية تقريبا على الجانب الشرياني لتداول لها الصفيحة المرنة الداخلية التي تقع بين وendotالهيليوم والطبقة الأعمق من خلايا العضلات الملساء. 8 وعلاوة على ذلك، فإن معظم المواد خارج الخلية بين العضلات الملساء وطبقة البرانية هو الكولاجين. 8 الإيلاستين والكولاجين هي مصدر رئيسي من السيارات ومضان مع كثافة عالية ومجموعة واسعة من موجات الإثارة . مضان خلفية قوية مع زيادة مستوى تشتت الضوء أثناء التصوير متحد البؤر تنتج القرار إشارة منخفضة، وبالتالي، انخفاض الكشف عن إشارات الكالسيوم أو NO الإنتاج. العامل المحدد التحميل تحقيقات فلوري إلى خلايا الأوعية الدموية في تركيزات كافية لإجراء قياسات ذات مغزى يمكن حلها باستخدام المجراة سابقا إعداد والمجهر اثنين الفوتون، وتطبيق طبقة جديدة من ionophores، مثل اشانتي الأحمر، والتي تنبعث مضان بعد طول انتظار الأطوال الموجية، حيث هناك تداخل أقل من السيارات ومضان من النسيج الضام والألياف. ومع ذلك، واحدة من القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه ضيفficult على الجمع بين اثنين أو أكثر من الأصباغ أثناء التصوير. أطياف الإثارة لمعظم الأصباغ المتاحة لمدة التصوير فوتون لها، وخصائص توزيع polymodal واسعة، الأمر الذي يجعل من الصعب على قياس اثنين ionophores مختلفة في نفس الوقت. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم للكشف عن الهجينة انخفاض مستوى الضجيج إلى تضييق أطياف الانبعاث الكشف على افتراض أن ionophores ينبعث الضوء بأطوال موجية مختلفة. على سبيل المثال، في هذا الإجراء وصفه أنه من غير الممكن لقياس كل من NO إنتاج والكالسيوم 2+ التغييرات التركيز لأطياف الانبعاثات تتداخل.

تتعرض خلايا بطانة الأوعية الدموية التي هي على اتصال مباشر مع تدفق الدم إلى إجهاد القص السوائل وتنظيم التوازن الأوعية الدموية. 9 الطريقة الحالية يمكن تطبيقها أيضا لمراقبة العابرين الكالسيوم التي يسببها تدفق وNO الإنتاج في الخلايا البطانية خارج الحي. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها بنجاح لدراسة كا 2+ concentraتغييرات نشوئها في خلايا العضلات الملساء في الشرايين مقاومة صغيرة المستخرجة من الكلى. في هذه الحالة، يجب أن تكون المحتضنة الشرايين مقاومة صغيرة تشريح في كا 2+ حل خالية لتجنب سلس تلف الخلايا العضلية بسبب الكالسيوم 2+ الزائد. ويمكن أيضا أن تطبق هذا التعديل إلى الشريان الأبهر للحد من موت الخلايا.

وجهات النظر. وقد تم التصوير على أساس مضان تستخدم على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا الخلوية في المختبر. ومع ذلك، ونماذج زنزانة انفرادية لا ألخص دائما العمليات الفسيولوجية التي تحدث عندما كانت الخلايا في بيئتها الأصلية. وهذا يحد من تطبيق خطوط الخلايا للبحوث متعدية. 10 كما هو موضح هنا، أعطانا استخدام خارج الحي استعدادات الفرصة لمراقبة سلوك الخلايا في الأنسجة المعزولة حديثا حيث جميع العمليات الفسيولوجية المحلية والتفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى ما زالت تحدث . مع العدد المتزايد من انجين الجينيتقنيات eering المتاحة وتطوير النماذج التي تلخص الأمراض التي تصيب الإنسان، فيفو السابقين الاستعدادات ستكون أداة مفيدة للبحث متعدية. للدراسات وصفها هنا، تم استخدام دال الملح الحساسة (SS / JrHsdMcwi) سلالة الفئران ارتفاع ضغط الدم. الفئران SS هو نموذج الجيني الفطرية التي تحدث بشكل طبيعي من ارتفاع ضغط الدم حساسية للملح الذي يلخص جوانب كثيرة من ارتفاع ضغط الدم البشري التدريجي. ويجري استخدام هذا النموذج على نطاق واسع وقدمت أفكارا رئيسية في الآليات الكامنة وراء الملح حساسية وضعف الأوعية الدموية. 11-13 مع هذا النموذج الفئران، تمكن الباحثون لاختبار مساهمة الآليات الأساسية للأمراض المعقدة (مثل ارتفاع ضغط الدم) باستخدام ZFNs ، TALENs، وكريسبر / تكنولوجيا الجينات على أساس التحرير كاس. 6،14-17 عن طريق إجراء التجارب وصفها هنا جنبا إلى جنب مع هذه الموارد الجينية والتحرير، وأصبح من الممكن الآن لبدء اختبار مساهمة الكالسيوم والعوامل الرئيسية الأخرى على الملح -sensitiveارتفاع ضغط الدم وضعف الأوعية الدموية في العديد من نماذج حيوانية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر الدكتور ويليام Cashdollar، ومركز نورث وسترن المتبادلة التصوير مؤسسة في معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في الدراسات التصوير. كما نشكر الدكتور داريا Ilatovskaya لقراءة نقدية لهذه المخطوطة ومناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL108880 (لAS) وDP2-OD008396 (لAMG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAF-FM Life Technologies D-23842
Fluo-4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution Sigma-Aldrich P5556
L-NAME Tocris 0665
Olympus upright microscope Olympus Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL  Spectra Physics Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters Olympus FV10-MRL/R  495 to 540 nm 
25× water-immersion objective lens Olympus XLPL25XWMP N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid  Warner Instrument  SHD-27LH
Other basic reagents  Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
  3. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
  4. Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
  5. Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
  6. Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
  7. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
  8. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
  9. Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
  10. Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
  11. Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
  12. Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
  13. Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
  14. Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
  15. Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
  16. Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
  17. Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 100، ثنائي الفوتون المجهري، مضان، الأوعية الدموية، الكالسيوم داخل الخلايا، فلوو-04:00، أكسيد النيتريك، DAF-FM، الشريان الأورطي، الفئران
التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, B. T., Staruschenko, A.,… More

Endres, B. T., Staruschenko, A., Schulte, M., Geurts, A. M., Palygin, O. Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta. J. Vis. Exp. (100), e52734, doi:10.3791/52734 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter