Abstract
Oxidativt stress, som er resultatet af en ubalance mellem produktion og afgiftning af reaktive oxygenarter, er en stor bidragyder til kroniske humane lidelser, herunder kardiovaskulær sygdom og neurodegenerative sygdomme, diabetes, ældning, og cancer. Derfor er det vigtigt at studere oxidativt stress ikke kun i cellesystemer men også anvende hele organismer. C. elegans er en attraktiv model organisme for at studere genetik oxidative stress signaltransduktionsveje, som er stærkt evolutionært konserverede.
Her giver vi en protokol til måling af oxidativt stress modstand i C. elegans i væske. Kort fortalt, ROS-inducerende reagenser, såsom paraquat (PQ) og H 2 O 2 opløses i M9 buffer og opløsninger alikvoteres i brøndene af en mikrotiterplade med 96 brønde. Synkroniseret L4 / unge voksne C. elegans dyr overføres til brøndene (5-8 dyr / brønd) og overlevelse måleshver time indtil de fleste orme er døde. Når du udfører en oxidativ stress modstand under anvendelse en lav koncentration af stressfaktorer i plader, aldring kan påvirke adfærden hos dyr upon oxidativ stress, som kan føre til en fejlagtig fortolkning af data. Men i assayet beskrevet heri, er usandsynlig, da kun L4 / unge voksne dyr bliver brugt dette problem. Desuden er denne protokol er billig og resultater opnås på én dag, hvilket gør denne teknik attraktivt for genetiske skærme. Samlet set vil dette hjælpe til at forstå oxidative stress signaltransduktionsveje, som kunne omsættes til en bedre karakterisering af oxidative stress-associeret menneskelige lidelser.
Introduction
I eukaryoter, oxidativ fosforylering finder sted i elektron transportkæden af mitokondrier er den vigtigste drivkraft for energiproduktion i form af ATP. Reaktive oxygenarter (ROS) er et naturligt biprodukt af denne proces. På trods af deres vigtige rolle som signalmolekyler, kan overdreven ROS føre til DNA-skader, protein carbonylering og lipid oxidation. En ubalance mellem ROS produktion og afgiftning forårsager oxidativt stress, hvilket fører til energiudtømmelse, cellulære skader, og udløser celledød 1,2. Oxidativt stress bidrager til aldring og til udviklingen af mange livstruende sygdomme, herunder kræft, diabetes, hjerte-kar og neurodegenerative sygdomme 3-9.
Celler har udviklet enzymatiske og ikke-enzymatiske forsvarsstrategier at opretholde ordentlig ROS niveauer, og for at beskytte deres vælgere mod oxidativ skade 1,2. Superoxiddismutase (SOD) enzymer virker først til Convert superoxid til H 2 O 2, som senere omdannes til vand ved katalase eller peroxidase enzymer. Ikke enzymatiske forsvarsstrategier omfatter hovedsagelig molekyler der reagerer hurtigere med ROS i sammenligning med cellulære makromolekyler, beskyttelse essentielle cellulære komponenter. På trods af den beskyttende rolle ROS afgiftende enzymer, nogle ROS molekyler undslippe antioxidant forsvarsmekanismer og føre til oxidative skader. Detection, reparation, og nedbrydning af de beskadigede cellulære komponenter er vigtige forsvarsstrategier under oxidativ stress 1,2.
Signalveje, der er involveret i stress resistens og specifikt oxidativ stress er stærkt evolutionært konserverede 10,11. I modsætning til celle kultur eksperimenter, hvor organismal betingelser er kun delvist gengives, studiet af oxidativt stress i modelorganismer 12,13 har stor betydning. C. elegans er en fritlevende nematode, der kan være let og billigt cultured på en bakteriel plæne på agar medie. Det er lille i størrelse (ca. 1 mm i længden) og normalt vokser som en selvstændig befrugtende hermafrodit, hvilket letter genetiske manipulationer. Det har en hurtig livscyklus og en høj reproduktionsevne, der producerer omkring 300 afkom pr generation, hvilket gør det et stærkt værktøj til at udføre store genetiske skærme 14. C. elegans genom er fuldt sekventeret og 40-50% af generne forudsiges at være homologer af human sygdom-associerede gener 15-18. Knockdown af gener af interesse ved anvendelse RNAi er hurtigt og let i C. elegans. Gene nedregulering kunne opnås ved at fodre dyr E. coli-bakterier, der huser et plasmid, der udtrykker dobbeltstrenget RNA, som målretter mRNA'et af interesse 19. Derfor bestemmelse af gen-funktion ved hjælp af store skala RNAi skærme har stor betydning for forståelsen af menneskelige sygdomme, herunder kræft 20,21.
Undersøgelser af oxidative stress modstand i C. elegans har ført til identifikation af konserverede resistensmekanismer til oxidativ stress 13,22. Nogle veje identificeret, er almindelige veje, der modulerer lang levetid og modstandsdygtighed over for andre spændinger samt såsom hypoksi, varme og osmotisk stress. Disse veje omfatter insulin signalering, TOR signalering, og autophagy. Andre vigtige veje involverer afgiftning af ROS såsom superoxiddismutase enzymer og katalase-enzymer, eller skader reparation såsom varmechok og chaperoneproteiner 11,13,22.
Denne protokol beskriver, hvordan at bestemme modstanden mod oxidativ stress C. elegans i væske. Vi brugte flcn-1 (ok975) og vild-type dyr at demonstrere protokollen, da vi tidligere har vist en øget modstand mod oxidativ stress på tab af flcn-1 (ok975) i C. elegans 23. Vi har også vist, at denne øgede modstand afhængerpå AMPK og autophagy, et signalsystem akse, der forbedrer cellulære bioenergetik og fremmer stress modstand 23. PQ er en oxidativ stressor, der forstyrrer elektrontransportkæden at producere reaktive oxygenarter 24. Det samme assay kan tilpasses og andre ROS kilder eller ROS genererer forbindelser kunne anvendes, såsom H 2 O 2 og rotenon. Lignende analyser er blevet udviklet på plader, hvor lave koncentrationer af PQ anvendes 25,26. Fordelen ved dette assay er, at det er meget hurtig, og resultaterne kunne opnås på én dag. Derudover, det samlede volumen af væske, der anvendes til at udføre den oxidative stress resistens assay i 96 brønds plader er lav i forhold til den mængde der anvendes til fremstilling PQ-holdige plader. Derfor er mængden af PQ anvendes, er i flydende assay er lav, hvilket gør assayet billig og begrænser produktionen af giftigt affald. Dog begrænsninger dette assay sammenlignet med plade-assays omfatter lack af fødevarer i flydende assay og den lavere koncentration af oxygen i væske i forhold til luft. Disse er vigtige faktorer, der i nogle tilfælde kan påvirke resultaterne. Derfor bekræfter reproducerbarhed ved hjælp af andre metoder til oxidativ stress resistens anbefales at understøtte resultaterne opnået i dette assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
- Fremstilling af medier til C. elegans vækst (i dette tilfælde, vildtype dyr og flcn-1 (ok975) mutant dyr).
- Fremstille modificerede Youngren eneste Bacto-pepton (MYOB) tørblanding indeholdende 5,5 g Tris-HCI, 2,4 g Tris-base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl og 0,08 g kolesterol. Bland godt under omrystning.
BEMÆRK: Denne blanding er tilstrækkelig til at forberede 10 l MYOB medium.
Bemærk: normale vækstmedium (NGM) plader kunne anvendes i stedet for MYOB plader 27. Imidlertid bør den samme type plader anvendes til gyldige sammenligninger mellem stammer og mellem uafhængige gentagelser. I denne protokol, kun vi brugte MYOB plader. - Forbered 1 L MYOB medium ved tilsætning af 6 g MYOB tør blanding, 17 g agar og der fyldes op til 1 l med H2O og autoklave i 45 minutter ved 122 ° C. Hæld pladerne og lad tørre ved stuetemperatur i 2 dage.
- Under anvendelse af steril teknik pode 100 ml culture af LB-bouillon medium med E. coli OP50 bakterier og vokse O / N ved 37 ° C.
- Seed MYOB plader med E. coli OP50 bakterier. Lad det vokse ved stuetemperatur i 48 timer.
- Fremstille modificerede Youngren eneste Bacto-pepton (MYOB) tørblanding indeholdende 5,5 g Tris-HCI, 2,4 g Tris-base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl og 0,08 g kolesterol. Bland godt under omrystning.
- Forberedelse til gen-nedregulering hjælp RNAi
- Forbered MYOB RNAi-fodring plader. Fortsæt som i trin 1.1.1 og 1.1.2. Efter autoklavering tillade mediet at køle ned til ca. 55 ° C, og der tilsættes 1 ml 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og 1 ml 100 mM ampicillin.
- Streak E. coli HT115 bakterier transformeret med et plasmid, der udtrykker enten kontrol EV eller flcn-1-specifik RNAi på ampicillin (50 ug / ml) / tetracyklin (15 ug / ml) agarplader. Vokse kulturen O / N ved 37 ° C.
- Pick kolonier og pode E. coli HT115 bakterier transformeret med et plasmid, der udtrykker enten kontrol EV eller flcn-1-specifik RNAi og vokse kultur i LB / ampicillin (50 pg / ml) medium og O / N på 37 & #176; C.
- Seed plader med E. coli HT115 El bakterier eller HT115 flcn-1 RNAi bakterier.
BEMÆRK: Hold pladerne 48 timer ved stuetemperatur før brug. Hvis RNAi knockdown ved fodring er i effektiv, bruge andre metoder til levering af ds-RNA 28.
- Inducerende oxidativt stress ved hjælp af paraquat (PQ):
- Forbered M9 buffer ved at blande 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl og 0,25 g MgSO4 · 7 H2O Bring op til 1 l med destilleret vand. Autoklave opløsning i 45 minutter ved 122 ° C og opbevares flasker ved stuetemperatur.
- På dagen for assayet forberede M9 / PQ-opløsning. Til denne protokol, bruger 100 mM PQ (0,1028 g PQ opløst i 4 ml M9 buffer fylder en hel 96-brønds plader med 40 pi M9 / PQ per brønd).
ADVARSEL: PQ er en farlig og meget toksisk forbindelse. Håndtag ifølge passende retningslinjer.
BEMÆRK: Når først kører en ny stog eller en ny tilstand, anbefales det at analysere overlevelse i stigende koncentrationer af PQ at bestemme den bedste koncentration til brug for at dræbe dyrene inden 7-10 timer.
2. Fremstilling af Age-synkroniseret L4 Befolkning
- Overførsel 20 drægtige voksne hermafroditter til en frisk MYOB plade podes med E. coli OP50 bakterier. Forberede flere plader baseret på antallet af orme, der er nødvendige under assayet.
- Lad dem lægge æg i 6 timer, og derefter bruge en platintråd orm pick fjerne mødre. Kontroller pladerne under mikroskop for at vurdere antallet af æg, der er.
- Tillad æggene at klække og vokse ved 20 ° C i 48 timer. På dette tidspunkt, at dyrene er i en sen L4 / unge voksne stadium. Pick fase dyr samme og overføre til PQ løsning indeholder brønde.
BEMÆRK: Siden 48 timers inkubation gælder kun for mutanter, der vokser på samme måde som vildtype-dyr, er det vigtigt at overvåge udviklingsmæssigesats af nyligt testede mutanter for at sikre den opfylder udviklingen sats vildtype, ellers bør der anvendes andre tidsplaner. - Alternativt kan du bruge synkronisering teknikker. Generere synkroniseret population af L1 larver orme ved hjælp hypochloritopløsning (25 ml vand, 125 ml 5,25% natriumhypochlorit, 50 ml 4 M NaOH; wrap flaske med aluminiumfolie for at isolere mod lys). Men for denne analyse, er det ikke anbefales, da intens blegning kan påvirke adfærden hos dyrene under analysen.
FORSIGTIG: Håndter hypochloritopløsning efter retningslinjer.
BEMÆRK: Når du bruger RNAi til nedregulere genet af interesse, synkronisere hermafroditter som beskrevet i afsnit 2, med undtagelse af overførslen af mødrene til RNAi plader podet med de specifikke RNAi bakterier. Når knockdown med RNAi er svag, er fodring til flere generationer anbefales.
3. Udførelse af oxidativ stress Resistance Assay </ P>
- Pipetten 40 pi af 100 mM PQ-opløsning (fremstillet frisk) til hver brønd i en plade med 96 brønde. Brug mindst 12 brønde som replikerer af hver betingelse (behandling, mutant, etc.). Ved hjælp af en platintråd orm pick, overfører 5-8 L4 larver dyr til hver brønd angiver starttidspunkt og sluttidspunktet.
- Når du starter en anden betingelse, bemærk starttidspunktet og sluttidspunktet. Pladen anbringes ved 20 ° C i inkubationstiden mellem overføre orme og lave døde dyr en time senere fra starttidspunktet.
- Ved hjælp af dissektionsmikroskop, tæller overlevelse hver time. Ryst forsigtigt pladen, før du begynder at tælle. Indikerer orme, der ikke bevæger sig, selv efter spotting en høj intensitet lys, som døde dyr. Også angive antallet af dyr i live.
BEMÆRK: Ser man på orm form, haler og hoved bevægelse ved stor forstørrelse, hjælpe med at bestemme døde orme fra live. - Gentag dette trin, hver time, indtil de fleste orme er døde.
- Beregn det samlede antal dyr pr tilstand ved at tilføje det samlede antal dyr, der er overført til hver brønd. Ignorer de dyr, der er beskadiget eller dræbt ved overførsel.
- For hvert tidspunkt, beregne det samlede antal døde dyr pr betingelse (summen af døde dyr i de 12 brønde). For hvert tidspunkt, beregne procentdelen af dødsfald (antallet af døde dyr divideret med det samlede antal dyr, og ganget med 100) og procentdelen af overlevelse (100 minus procent død).
- Gentag dette assay mindst 3 uafhængige gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligne vildtype C. elegans at flcn-1 (ok975) mutante dyr
Her anvendte vi 100 mM PQ at bestemme modstanden af vildtype C. elegans-dyr sammenlignet med flcn-1 (ok975), som har vist sig at modstå oxidativ stress, varme og anoksi 23. Efter 4 timer af behandlingen, 48,3% af vildtype overlevede sammenlignet med 77,8% overlevelse i flcn-1 (ok975) dyr. Som forventet flcn-1 (ok975) mutante dyr var mere resistente over for 100 mM PQ sammenlignet med vildtype (figur 2 og tabel 1).
Sammenligne vildtype dyr fodret med kontrol EV eller flcn-1 RNAi bakterier
Svarende til resultatet præsenteres i det foregående afsnit, nedregulering af flcn-1 under anvendelse af RNAi forøgede resistens over for 100 mM PQ. Dette resultat viser, at nedregulering af genet funktion ved hjælp RNAi efterligner tab-of-funktion m utation (figur 2 og tabel 1).
Figur 1. Skematisk figur af fremgangsmåden til oxidativ stress resistens bestemmelse i 96 brønds plader i C. elegans.
Synkroniserede L4 / unge voksne dyr dyrket på MYOB plader og fodret med E. coli OP50 bakterier overføres til brøndene i en mikrotiterplade med 96 brønde indeholdende 100 mM PQ og overlevelse måles hver time, indtil et stort antal orme er døde. I tilfælde af RNAi knockdowns, er den samme procedure fulgt bortset fra, at de synkroniserede dyr dyrkes på plader suppleret med IPTG, og fodres med E. coli HT115 bakterier indeholdende plasmidet, der vil knockdown målgenet efter ekspression.
filer / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
Figur 2. Tab af FLCN-1 øger modstand mod oxidativ stress i C. elegans. (A - B) Procentvis overlevelse til 100 mM PQ af (A) wt og flcn-1 (ok975) mutante dyr og (B) wt dyr behandlet med kontrol eller flcn-1 RNAi.
| Procent overlevelse til 100 mM PQ | |||||
| 1 time | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 82,38 ± 1,31 | 0,0002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 99.03 ± 1,67 | 3 224 | |||
| vægt; kontrol | 91,70 ± 0,55 | 0,0462 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 95,93 ± 2,48 | 3 | 207 | ||
| 2 timer | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 72,13 ± 7,13 | 0,005 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 96,33 ± 2,28 | 3 | 224 | ||
| vægt; kontrol | 80,27 ± 5,34 | 0,0261 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 91,23 ± 1,42 | 3 | 207 | ||
| 3 timer | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 55,37 ± 4,72 | 0,0004 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 87.00 ± 1,36 | 3 | 224 | ||
| vægt; kontrol | 70,77 ± 3,50 | 0,0027 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 87,63 ± 2,67 | 3 | 207 | ||
| 4 timer | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 48.30 ± 6,39 | 0,002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 77,80 ± 3,12 | 3 | 224 | ||
| vægt; kontrol | 63,77 ± 0,66 | 0,0122 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 80,57 ± 6,68 | 3 | 207 | ||
| 5 timer | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 41.60 ± 8,33 | 0,0062 | 3 | ||
| flcn-1 (ok975) | 67,43 ± 1,42 | 3 | 224 | ||
| vægt; kontrol | 60,53 ± 2,58 | 0,0313 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 71,53 ± 5,24 | 3 | 207 | ||
| 6 timer | Strain, RNAi | Procent overlevelse (± SD) | P Value | Række eksperimenter | Samlet antal orme |
| vægt | 34,86 ± 5,88 | 0,0021 3 | 210 | ||
| flcn-1 (ok975) | 60,34 ± 2,05 | 3 | 224 | ||
| vægt; kontrol | 44,43 ± 3,93 | 0,0042 | 3 | 202 | |
| vægt, flcn-1 (RNAi) | 62.13 ± 3,44 | 3 | 207 | ||
Tabel 1. Oversigt over resultater og statistisk analyse af oxidativ stress modstand fra figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans er en attraktiv model organisme for at studere genetisk oxidativt stress resistens in vivo, eftersom det kan være let dyrkes, og hurtigt fører til et stort antal genetisk identiske afkom. Flere metoder til måling oxidativt stress resistens er tidligere blevet beskrevet, og de er baseret på tilskud af dyrkningsplader med forskellige ROS kilder såsom PQ, rotenon, H 2 O 2, og juglone 25,26,29-32. Her beskriver vi en protokol der måler oxidativt stress resistens i væsken i 96 brønds plader under anvendelse af 100 mM PQ. Et lignende assay er blevet udført af Greer et al. 33. Dette assay kan tilpasses yderligere til at studere oxidativt stress i flydende ved hjælp af andre ROS kilder. For eksempel har vi vist, at tabet af flcn-1 øger modstand mod flere H 2 O 2 koncentrationer samt 23.
Dette assay kan være tekniskly udfordrende for nogle stammer, der viser motilitet fejl eller swimming-induceret lammelse fænotyper såsom stammer, der bærer en mutation i dopamin-transporteren dat-1 34. I dette tilfælde, den manglende evne til at bevæge sig er forvirrende, da det betyder ikke nødvendigvis, nedsat oxidativt stress modstand, men snarere en motilitet defekt. Endvidere bør optælling af døde dyr omhyggeligt afsluttet og forskere nødt til at være opmærksom på C. elegans adfærdsmæssige detaljer såsom hale bevægelser og hoved bevægelser, eller endda langsomme kropsbevægelser. Hvis PQ koncentrationen er for høj, og døds- kinetik dyrene er meget hurtigt, kunne man overveje at reducere koncentrationen af PQ for at få langsommere dødelighed. Nogle dyr er ekstremt følsomme over for oxidativ stress, såsom AAK-2 mutante dyr 26,33,35,36 mens andre er meget modstandsdygtige såsom daf-2 mutante dyr 37. I dette tilfælde analyse overlevelse med forskellige concentrations af PQ bør overvejes.
For RNAi eksperimenter, kunne negative resultater skyldes en ineffektivitet af RNAi behandling. I dette tilfælde er afgørende måling af mRNA-niveauer til at bestemme, om genet knockdown er vellykket.
Denne protokol kan tilpasses yderligere til high throughput screening af oxidativ stress resistens ved hjælp af en detektor, der sporer svømning adfærd C. elegans i flydende 38,39. Dette ville potentielt gøre det muligt at overvåge udholdenhed af C. elegans og svømning adfærd såsom hyppigheden af kroppen bøjning under oxidativ stress. Højere kroppens bevægelser kan indikere højere orm fitness under stress.
Veje, der fører til oxidativ stress resistens i lavere eukaryoter er stærkt konserverede tværs evolution og er forbundet med oxidative stress-associerede sygdomme og aldring hos mennesker. Mitohormesis og den afbalancerede generation af ROS er afgørende for at forlænge levetiden og forbedre sundheden span. Men overdreven ROS er yderst skadeligt for celler, væv / organer og organismer. At finde veje, at hvis ændret, giver en optimal ROS balance er således afgørende, og de skærme til lægemidler, der modulerer modstand mod oxidativ stress kan bidrage til udviklingen af kure for flere sygdomme med fællesnævneren: oxidativ stress. Udførelse af disse screeninger i C. elegans er en fordelagtig hurtig, billig og pålidelig metode, der har et stort potentiale og værdi for forståelsen og behandling af humane sygdomme knyttet til oxidativ stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi anerkender Caenorhabditis Genetik Center for C. elegans-stammer. Finansiering støtte blev leveret af Terry Fox Research Institute. Vi anerkender også støtte til EP fra Rolande og Marcel Gosselin Graduate Studentship og CIHR / FRSQ træning tilskud i kræftforskning FRN53888 af McGill Integrated Cancer Research Training Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60 x15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library |
References
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y.
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J.
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M.
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S.
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
