Abstract
在多能干细胞培养持续进步是，使得收盘板凳和床头之间的差距在再生医学，药物发现和安全测试使用这些细胞。为了生产干细胞衍生的生物药剂和细胞组织工程和移植，具有成本效益的电池制造技术是必不可少的。多能性和性能细胞的下游应用（ 例如 ，细胞分化），随着时间的推移稳定的维护是极为重要的大型电池生产。然而，这可能难以实现，特别是如果细胞是手动培养，其中操作者可以引入显著变性以及非常昂贵按比例扩大。要使用台式多通道液体处理机器人所开发的需要最少的技术人员参与或经验，使高通量，大规模的干细胞生产和删除操作人员的影响新型干细胞培养协议。同这些协议的诱导的人多能干细胞（iPS细胞）是在无饲养条件下培养，直接从冷冻的储存，并保持在96孔板中。取决于细胞系和所希望的放大比率时，操作者能够方便的时候通过基于一系列图像，显示的最优菌落密度为分裂的确定。那么必要的试剂准备进行拆分殖民地新板不离心步骤。后20通道（〜3个月），两个iPSC系保持稳定的核型，表达干细胞标记物，并分化成具有高效率的心肌细胞。该系统可以执行的设计用于96孔板新分化的协议或遗传操作随后的高通量筛选。这项技术将减少劳动力和技术负担，产生大量相同的干细胞为无数的应用。
Introduction
6 -利用人体诱导多能干细胞（iPS细胞）的已显著，因为它们的推导在2007年1化合物测试，再生医学和疾病建模2增加。这种需求来自iPSC的的能力，以产生大量的多能干细胞，它可以在一个无与伦比的数量分化成体细胞。作为定向分化技术提高7 - 10和人体细胞或组织建模和细胞疗法的发展增加了11 - 14，所以确实为大量生产高品质的iPSC的要求。它被广泛引用，其它的疾病中，心肌梗塞或B细胞功能替代将需要数亿至数十亿的iPSC衍生的体细胞15 - 18。此外，日益复杂的3D建模组织对药物发现和Therapy将需要大量的细胞9,13,19的。在所有这些例子中，所定义的均匀和可再现的iPSC必须提供和直接产生。
为了生产干细胞衍生的生物药剂和细胞组织工程和移植，具有成本效益的电池制造技术是必不可少的。规模化生产iPS细胞都集中在悬浮培养20 - 25或中止与使用微载体基板26 - 28部分是因为这些技术成功地部署了大规模，非IPSC的，真核为主的生产。一些研究小组已经证实，得到的多能干细胞20,21,23,24,29悬浮培养系统。然而，这些方法利用不容易获得的研究人员开发新的分化方案昂贵且复杂的系统，驾驶组织工程和操作的实验室及其他实验室ORY规模的研究。此外，悬浮液和微载体的iPSC培养需要适应和技术或传统的贴壁的iPSC培养未发现的化学物质，如连续使用Rho激酶抑制剂，消泡剂和过滤来调节聚合。物理应力的细胞是在悬浮培养更为普遍，通过机械搅拌以及微载体碰撞过程中引入的。这些问题限制了可预测性和速度，新产生的干细胞系可以在悬浮液中培养。其他已开发出模仿板培养技术30,31机器人板处理系统，但这些平台需要显著用于投资的设备和专业技术除了具有干细胞培养相关的基本挑战进行操作。
下面的工作说明了发展和一个可伸缩的iPSC培养系统的实践，利用一个自包含的，标准的8通道机器人液体处理程序和96孔板中。这种方法旨在弥合实验室规模的iPSC文化和高容量的iPSC生产（ 如 10 7 - 1.5×10 9细胞每周每个技术人员），使那些开发新的iPSC技术，轻松扩大生产没有大的硬件或劳务的投资。这种方法是相对便宜的设置，需要很少或没有干细胞培养，编程或工程经验，具有小的设备占地面积，而不需要专门的细胞培养罩，并利用标准的细胞培养设备，以使介质自动化高吞吐量电池生产。这样做的目的是开发能够可以通过实验室新的干细胞培养可以利用可扩展的干细胞培养体系，那些谁找到人工栽培的障碍，以发展自己的想法或那些想要一种经济手段，产生大量的干细胞。这里介绍的平台上删除技术的影响干细胞培养和标准化饲养通道程序，使一致的干细胞生产。
Protocol
机器人液体处理系统，该系统对以下协议是吉尔森的pipetmaX，便于自动化的，可扩展的干细胞培养和生产，同时保持传统的贴壁培养条件下，在96孔板格式。像传统的6孔板培养，iPS细胞生长与该协议作为不同菌落的单层，但在96孔板格式。每个孔可以是同基因的或不同的，要么配置可以并行培养由于机器人可以保持每孔隔离。典型的机器人的iPSC培养例程有两个阶段：一个馈送程序，其中培养物被送入一个自定义的时间表和在用户选择的解离方法和分束比，从而控制接种密度和规模速率的通道程序。以下协议描述了如何一个新的文化开始，如何喂养和通道得以实现，并为补充方案，以促进文化的iPSC。
1.准备外基质凝胶涂层96孔板
- 来自六个新，RT 96孔板除去包装，并放置在液体处理机器人床中的位置2，3，5，7，8，9（参见图1A，用于床位置）上。
- 放置一预冷，4℃4孔槽在床位置6。
- 尖端架在床位置1装入列12预冷，4°C 200微升枪头。
- 通过使用无菌技术浇注的等分试样填充第一（最左）槽以及在床位置6用25ml 4℃的DMEM / F12。另外，用吸管来完成转移。
- 除去96孔板盖和滑动每个进入特殊设计的板盖保持架（PLHR， 见图1A）。避免接触用板盖的内侧。
注意：处理的板盖内侧或堆叠的板盖，其中一个盖子的内侧接触的另一个所述外是一个极好的路线有无污染。 - 使用机械手控制触摸板，按以下一系列的按钮来启动以及预润湿过程：
- 点击“运行协议”。
- 选择“细胞外基质凝胶预湿”，并点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”，使用一步一步的向导预先测试选定的程序。
注：该机器人不运行，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
- 在预润湿处理（步骤1.6）继续到步骤1.8。
- 解冻在冰上1 4毫克的生长因子等分减小包含在50毫升的细胞外基质凝胶（GFRM）锥形管储存于-80℃。保持等分在冰上，直到准备使用。
注意：GFRM将凝固如果允许来至RT，并不会是有用的。 - 悬浮于24ml 4℃的DMEM / F12的4毫克GFRM等份用25毫升玻璃吸管。当传输的DMEM / F12，停顿2-3秒，以使吸管重悬GFRM等分之前冷却。
- 当预润湿处理（步骤1.6）完成后，继续到步骤1.11。
- 传送24毫升的DMEM / F12 GFRM混合物与槽的第四阱床上位置6。
- 使用机械手控制触摸板，按以下一系列的按钮以启动细胞外基质凝胶涂覆方法：
- 点击“运行协议”。
- 选择“细胞外基质胶等份”，并点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”，使用一步一步的向导预先测试选定的程序。
注：该机器人不运行，但拉泽R中的软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
- 当步骤1.12完成后，更换板盖。
- 转移的细胞外基质凝胶包被的96孔平板，以37℃，5％CO 2，潮湿的培养箱并保持有24小时，此时将板将准备使用或储存。
注：在情有可原，新涂的细胞外基质凝胶板可以培养后而O / N至24小时的潜伏期15-30分钟使用建议。 - 重复方案步骤1.1，1.3，1.5-1.6，1.10，和1.12-14直到所有的DMEM / F12与GFRM的被使用。
2.存储外基质凝胶涂层96孔板
- 从37℃，5％CO 2，潮湿的培养箱中取出细胞外基质凝胶包被的96孔板上。
- 可选：llow细胞外基质凝胶包被的96孔板来室温进到步骤2.3之前。
注意：此可选步骤将减少冷凝积聚时将板置于4℃。 - 放置在液体处理机器人床板中的位置2，3，5，7，8，9（参见图1A，用于床位置）。
- 在床上1位尖机架RT 200微升枪头负荷列12。
- 放置在床上的位置6四槽水库。
- 填孔4，用RT的DMEM / F12水库（最右边）。
- 除去96孔板盖和每个滑入PLHR。
- 使用机器人控制触摸板，按下按钮的组合如下：
- 点击“运行协议”。
- 选择“细胞外基质胶等份”，并点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”，使用一步一步的向导预先测试选定的程序。
注意：ROBOT没有跑，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
- 一旦完成，更换板盖子和从机座取出板。
- 用一个一英寸×6英寸石蜡薄膜带包装每个细胞外基质凝胶包被的96孔板（其中盖符合板）的整个侧面周围。一定要拉伸薄膜石蜡创建一个气密密封。
- 可选的：与已完成的细胞外基质凝胶涂层的日期标签板中，细胞外基质凝胶批号，用户名和任何其它信息。
- 存储板在4℃下，他们将是很好的使用长达两个星期。
注意：板已被成功地用于超出两周限制，然而，它不被推荐。
3.执行细胞集落接种密度梯度从现场或冷冻文化96孔板形式：如何启动或恢复正常通行间隔一个干细胞系
- 如果启动了冻文化，继续执行步骤3.2。如果开始与已经在平板上活干细胞培养，开始在步骤3.5。
- 由旋流管在37℃水浴中，直到只有一小块的冰保持解冻冷冻培养。
- 可选的稀释：解冻细胞到10ml RT在300×g离心干细胞生长培养基（SCGM），离心2分钟，吸出上清液介质并重新悬浮干细胞沉淀在7ml含10μMY27632新鲜SCGM。
注：此步骤消除了冷冻介质的结转。 - 继续执行步骤3.6。
- 使用酶或非酶的解离通道的细胞作为正常：如果与活开始，已经镀干细胞。尝试共有1.5-3万个细胞收获;通常是一个6孔板的一个孔中。离心收获的细胞为2分钟，在300×g离心，吸出上清液介质并重新悬浮干细胞沉淀在7ml含10μMY27632新鲜SCGM。继续执行步骤3.6。
- 确保细胞内，无论是从冷冻的或活的培养，悬浮在7ml的RT SCGM与10μM的Y27632。
- 在床上的位置一体的尖端机架RT 200微升枪头负荷列12。
- 放置在床上的位置2四槽水库。
- 放置一个新的细胞外基质凝胶包被的96孔板预温热至37℃，在床位置5和取下盖子将其放置在PLHR。
- 用移液管转移7毫升悬浮细胞对储层的井3或无菌倾。
- 使用机器人控制触摸板，按下按钮的组合如下：
- 点击“运行协议”。
- 选择“接种密度梯度”，并点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”，使用一步一步的向导预先测试的选择编程序。
注：该机器人不运行，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。
- 点击“运行协议”。
- 当稀释系列完成后，再覆盖板和放置在37℃，5％CO 2，潮湿的培养箱，直到下一次进给。
- 可选的：与日期，应变信息，用户名，介质类型和其他相关信息标记板。
- 在接下来的数天，使用以下协议4根据需要喂96孔板。
注：典型的干细胞板块将需要一个完整的媒体变化每24小时和SCGM不包含Y27632喂养;只有在通过后最初的接种。在此之前喂养，检查板的污染和菌落密度。有关详情，请监测菌落密度3.16步骤。 - 在接下来的几天中，C附近几列板的进入（通常列5-8）将接近理想的密度通道;以确定该密度，比较96孔板与记住以下信息显示在图3B中的密度范围：
- 通道时，大多数菌落之间的空间相邻的菌落直径的约25％。
注意：理，以确定时间流逝是摄食和生长的另一个周期将导致菌落制造接触，这应该被避免。
- 通道时，大多数菌落之间的空间相邻的菌落直径的约25％。
- 开始均匀稀释板，并开始正常培养，选择一个列，它是在理想的密度和通道。请参阅协议5通道。
4.饲养96孔板干细胞集落
注：以下协议描述了一个96孔的干细胞集落板的喂养。该技术可以扩展到容纳6总板平行。
- 取出96孔s统细胞集落板从37℃，5％的CO 2，湿润培养箱。
- 检查板是否被污染和细胞密度。为了养活，确保菌落密度低于理想的通道密度。参见图3B有关密度信息。
注：污染可能表现为混浊介质，并伴有难闻的气味。小，显然非iPSC的聚集也可能是在显微镜下检查可见。为了评估细胞密度，见上面的步骤3.16.1。 - 将96孔干细胞集落板在床位置3上的倾斜，37℃斜坡。
- 在床上1位尖机架RT 200微升枪头负荷列12。
- 将一个4孔槽在床上的位置2。
- 无论是无菌倒或吸管转移填充槽以及3在床上2位用8毫升新鲜，RT SCGM没有Y27632。
- 除去96孔板干细胞集落板盖将其放置在PLHR。
- 使用机器人控制触摸板，按下按钮的组合如下：
- 点击“运行协议”。
- 选择“殖民地饲料一块板”，并点击下一步。
- 用户决定：轻按“试运行”，使用一步一步的向导预先测试选定的程序。
请注意，机器人不会运行，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
- 当馈送协议完成后，再覆盖96孔干细胞集落板，并返回到37℃，5％CO 2，潮湿的培养箱，直到下一次喂养或通道是必需的。这在24小时后，通常需要。
注意：建议记录在盖板与日期，媒体类型，用户名称和其他相关信息的馈送事件。
5.传代96孔PL吃干细胞集落
- 经过多次饲养周期96孔干细胞集落盘将准备通过。这个协议描述了一列的通过一个96孔板，代表1:12分流比。用户可以定义的分流比和选择任何数量的井或列的分裂，包括选择的孔可能不相邻的。
- 比较96孔干细胞集落板密度图3B，以确定是否通过。理想的通道密度是当大多数菌落之间的空间相邻的菌落直径的大约25％或随后馈送将导致生长成彼此的菌落。
- 检查在显微镜下对96孔板干细胞集落板，以确保没有污染。
- 将96孔干细胞集落板在床位置3上的倾斜，37℃斜坡。
- 负载列8-12在床位置1尖装载机架RT 200微升吸管提示。
- 将一个4孔槽在床上的位置2。
- 离开槽以及1空，把8.5毫升SCGM + 10μMY27632井2，把3.5毫升30％蛋白和胶原溶解分离试剂（或基于EDTA解离试剂）井3，把4.5毫升PBS井4。
注意：所有的试剂可以是在室温或37℃。 RT蛋白水解和溶胶原解离试剂，在30％用PBS稀释被用于脂肪和成纤维细胞衍生的此处的iPSC培养说明。 - 放置一个新的，预热的37℃的细胞外基质凝胶包被的96孔平板在床位置5。
- 除去96孔板干细胞集落板盖，以及新的96孔板盖，并将它们两者在PLHR。
- 使用机器人控制触摸板，按下按钮的组合如下：
- 点击“运行协议”。
- 选择“殖民地拆分1:12第1栏”，然后点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”使用在一步一步的向导预先测试选定的程序。
注：该机器人不运行，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
- 一旦通道协议完成后，再覆盖两个板。
- 可选的：以必要的信息标签新印版（ 即 ，日期，细胞系，通道号，媒体类型，用户名等 ）。
- 返回两个板到37℃，5％CO 2，潮湿的培养箱，直到下一次喂养或通道是必需的。注：下喂养24小时后典型。
注：细胞和殖民地应该重视的板块在2-3小时的分裂和看起来非常分散。这是由于对Rho激酶抑制剂的存在下，细胞会凝结并表现出特性干细胞形态（ 即，鹅卵石包装菌落的Wi日第一Rho激酶抑制剂自由摄食后小细胞体积变大核比）。
6.收获96孔板干细胞生产
注意：干细胞集落可以收获用于在培养过程中的任何一点。这通常发生在细胞准备通道（见5协议）。本协议描述了如何从一个96孔的干细胞集落板收获11列。
- 检查在显微镜下对96孔板干细胞集落板，以确保没有污染。
- 将96孔干细胞集落板在床位置3上的倾斜，37℃斜坡。
- 负荷列在床位置1的前端装载齿带有RT200μl的移液枪头11和12。
- 将一个4孔槽在床上的位置2。
- 离开槽以及1空，把8.5毫升SCGM井2，把3.5毫升30％蛋白和胶原溶解分离试剂（或基于EDTA解离试剂）以及中3，把4.5毫升PBS井4。
注意：所有的试剂可以是在室温或37℃。 - 取出96孔干细胞集落板盖板，将在PLHR。
- 使用机器人控制触摸板，按下按钮的组合如下：
- 点击“运行协议”。
- 选择“殖民地收获列2-12”，并点击下一步。
- 用户决定：点击“试运行”，使用一步一步的向导预先测试选定的程序。
注：该机器人不运行，而是软件测试协议软件问题。既定协议，攻丝，“跳过安装”是可以接受的。 - 点击“运行协议”。
注意：一旦收集过程完成后，细胞将在槽阱2和可以进行收集。
Representative Results
开发基于机器人板的干细胞培养平台。
为iPSCs的需求正在增长，因为它们在药物开发和再生医学效用。然而，可扩展的生产已排除许多研究人员和建立贴壁培养发散的方法相对复杂的设备集中在悬浮培养32。而不是彻底改变探明板基于干细胞的培养方法，例如切换到悬浮培养或使用微载体，我们专注于小型化和自动化，我们现有的粘附的iPSC培养技术。第一个目标是自动化饲养和传代正常化整个培养过程。能够快速规模与现有技术的平台也需要。为了实现这些目标的方法的要旨是，培养的干细胞在96孔平板使用自动液体处理系统（ 图1）。该PROT这里开发的所述液体处理机器人用于馈送和通路ocols不需要离心步骤或连续监测由技术人员。这些协议被开发了两个无饲养iPSC系;一位来自衍生的成纤维细胞，另一个来自脂肪细胞33。
计算机控制的液体处理系统（ 图1A）由一个平板是移动正面和背面的。床上有九个，约5×3.3英寸的编号凹槽与压力固定夹接受标准细胞培养板，液体水库等定制的硬件。吸管头移动到右（垂直于床上运动）以及上下离开。连同床，该移液管头可被编程为删除或从可再填充机架拾取枪头后在床上的任意位置递送介质。如果必要的话，每个96孔的可分开，以消除交叉污染。另外，在本结构中，0至200微升介质可以由吸管头的每个末端被移动，但是基于针尖大小等体积范围也是可能的。
当在标准板，酶或化学分解传代干细胞通常需要在37℃。初始测试证实离解用蛋白分解和溶胶原解离试剂或时间来离解菌落大小和均匀性产生于我们的两个96孔iPSC系进行在37℃，比室温既更好的EDTA的试剂（数据未显示）。自动执行分割处理，并避免移动板和缩小的培养箱，倾斜，温度控制斜坡接受的和可重复地定位标准培养板建（ 图1A）。当斜面被加热到37℃，水解蛋白和胶原溶解解离试剂或从96孔板的iPS细胞的EDTA的基于离解比得上置于37℃培养箱（数据n板加时赛示出）。倾斜斜面也用于实现枪头通过从平板达到在井内，而抽吸的最低点，以收集整个井的含量（低于5微升残余体积）左大约10-15微升的残留量，从而在细胞损失。的倾斜斜坡还允许井被清洗（研磨）通过在倾斜井顶部喷射介质，并收集它在底部。
干细胞在96孔板形式的机器人培养;饲养和传代。
使用机器人液体处理系统的iPSC的培养有两个阶段;通道和喂养。当一个集落准备通道，它被分割以预定的比率对种子的新板，然后以规则的间隔供给，直到它已准备好通过再次（ 图1B）。冷冻或非96-孔培养物可以开始在96孔格式，并立即进入通道/进料循环。未用于维持菌落，这是大多数的板的细胞，收获用于其它用途，并代表本系统的生产成分。
饲养96孔培养iPS细胞是有成就的，当一些媒体或全部一段时间的培养后，取出并存放于废物贮存。然后新鲜培养基等分到相同板。该机器人可以使用新的提示和媒体波谷到每一个分离为好完全可定制的喂养，包括与新媒体融合的条件培养基。
干细胞的典型通道需要解离和通常是一个离心步骤的方法。这里描述的方案旨在正常化解离和消除离心。通道协议开始时，机器人提供解离试剂到96孔板安装在37℃的倾斜坡道。在预设时间之后，所述解离收集细胞用洗涤动作，其中用户具有CONTROl相比的位置，重复，体积和研磨速率。酶时间，研磨速度和研磨的重复次数足以改变分离菌落大小和均匀性（ 图2），但每个参数是可调的，以适应一给定的细胞系的要求。这种控制消除变异由技术人员谁具有不同的价格，位置，和重复吸管出台。一旦解离的细胞被收集并汇集在同新鲜培养基的储库，它们分布到一个新的板。为了避免从底物降解或细胞死亡由于酶作用离心和播种的问题，解离试剂稀释到可接受的离解，导致可靠播种的最低点。这种技术是有效的蛋白水解和溶胶原解离试剂在mTeSR1介质34，其具有相对高的蛋白质含量，而且还有效地在低蛋白介质如原发性-8 35
控制干细胞通过后播种密度是极为重要的常规和成功的干细胞培养。播种过低或过高，可导致异位分化多能性和在除引起不规则通道间隔损失。典型的干细胞培养依赖于比分裂，其中一个6孔板的一个孔用于种子的整个新的6孔板（1:6分割）。用液体处理机器人这个比例可以调整，以适应用户的需要（ 例如 ，1：6,1：9，1:12， 等等 ），它有最大的影响在通道间隔。机器人可以收获小于一列一整列（8个孔），或一个以上的列取决于用户的需求，它应根据经验确定。脂肪和成纤维细胞来源的iPS细胞保持着经常3天喂食时间表，通过在第四天的时候拆1点12分。在这种情况下，一个列被收获并用于接种1新的96孔板中，创建一个1:12分裂，每个循环（ 图3A）。剩余的11口井当时可用于下游应用。收获这11口生产井，该通道的协议中，除了细胞被存入一个低谷的集合。可替代地，可以将细胞留在板上和直接使用。
从而获得稳定的接种密度通道到通道不计，并保持常规拆分时间表，我们的协议要求分裂的列相同的预定数目时，菌落是在一个理想的密度为通道。为了帮助用户确定正确的密度为通路，产生一系列图像示出了一个理想的通道密度突出（ 图3B）的范围内的密度的。以确定何时通路，技术人员检查他们的板，并比较其密度图像规模。这个想法升密度通道从脂肪和成纤维细胞衍生的iPSC的培养中测定，结果为，当大多数菌落之间的空间为约25％的邻接菌落的直径。重要的是，该菌落被均匀分布。这个量菌落分离的具有最大期望密度关联，因为一个额外的供给周期将导致菌落触摸，这是异位分化的触发器。
在这里开发的必要协议，解决了如何启动文化在96孔格式，以及如何经过密度问题，重置文化。当一种新的文化开始，传代前最好接种密度和饲养周期数是未知的。为了确保在接种后可用密度，机器人分布到一个96孔板现有的或解冻的细胞中的系列稀释（ 图4A）。这样的梯度的实施例结果示于图4B-E。经过多次喂养周期，某些列接近理想密度分裂，在该点，技术人员使用的机器人的种子均匀稀释板开始正规培养。该密度梯度协议也被用来恢复正常通道间隔和菌落同质不规则板。如果通道被延迟或遗漏，菌落密度和大小变得过高，而如果通道是太早，菌落密度过低和单个菌落可能会变得太大而不被均匀地分布在井。密度梯度协议解决了这些问题，并允许用户通过拾取一个理想接种组井的重新启动。
两iPSC系留3个月机器人文化的多能性后。
的干细胞的多能性维持可以通过培养条件36,37受到不利影响。为了评估是否脂肪和成纤维细胞来源的iPSC系（A-iPSC的，F-iPSC的，分别）保持pluripotency机器人在96孔板用于在延长的时间周期中培养时，这两条线分别在液体如上述3个月，然后多潜能标志物进行了检查搬运机器人上进行培养。对于这一时期都行传代用水解蛋白和胶原溶解分离试剂大于20次不离心。固定的96孔板从-iPSC的和f-iPSC系染色Oct4和Nanog的表现出这些标记核积累而SSEA-4，观察在细胞表面上（ 图5A-L）。这与多能性iPS细胞38之前的报道一致- 41。用DAPI复染并没有透露任何额外的细胞是不是也积极为三个多能性标志物。染色体异常中的干细胞培养42,43通常观察到，但可能不会影响的多能性标记物如图5A-L中所示的分布。 ķaryotype分析显示，这两个机器人传代iPSC系有46染色体正常，这表明机器人培养法没有出台超出了通常可能会出现（ 图5M-N）的染色体不稳定。
探测建立的干细胞的基因表达标志物在机器人培养iPSC系1,41,44,45，总RNA收集在平行于染色和核型分析。两个96孔板iPSC系具有多能标记NANOG，POU5F1和REX1类似的表达，而从每个系分化的心肌细胞没有，也没有人真皮成纤维细胞的一个独立的行（HDF）中（ 图6）。从两条线得到的心肌细胞MYL7阳性而将HDF和干细胞不表达MYL7。两种iPSC系分化成与小分子的心肌细胞，Wnt途径操作技术最近描述46 图7）阳性。分化成在96孔格式的心肌细胞是成功的在大于80％的孔的（数据未显示）。总之，这些数据表明3个月，超过20代机器人培养导致染色体正常细胞呈现的转录程序与多能性是也能够分化成心肌细胞是一致的。
图机器人干细胞培养设备和典型的iPSC文化例行1.概述（一 ）机器人液体处理显示为典型的床布置系统96孔干细胞培养。新的无菌枪头（TIPS），可拆卸尖端的废物容器（废物），多井高温高压消毒槽，以持有所需的液体试剂（液体），96孔板的定位 ð支撑在受控的温度下，倾斜的斜坡（96孔板），8通道机器人移液器头，其移动左/右和上/下（吸取头）。板盖保持架（PLHR）。在表中所示的床位置号码。 （ 二）机器人的iPSC文化有两个阶段：喂养和通道。电池生产的周期开始时的殖民地板已准备好通过。用户选择所希望的比例通道在和机器人的种子的96孔板的一个新的组，然后送入定期直到准备通道一次。当所述板准备通道，最各板的未使用的种子随后菌落板和可用于其他用途，因此代表了系统的生产阶段。冷冻的或现有的细胞系可以在任何时间被引入并维持在饲料/通道循环。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。机器人液体处理参数可被用来控制的iPSC集落解离特性 。每个代表性图像显示成纤维细胞衍生的iPSC所指示的处理后解离，同时仍然悬浮在96孔。 （上排，A - C）酶时间，无研磨。在96孔平板上生长的成纤维细胞衍生的iPSC经受进行增加的蛋白水解和溶胶原解离试剂解离和没有机器人研磨的次数。 （中排，D - F）研磨率，三分酶。细胞暴露到三分钟的蛋白水解和溶胶原解离试剂处理，然后175微升生长培养基加到各孔吸上下一旦在所指示的速率。微升/秒=微升p呃秒。 （下排，G - I）重名研磨3分钟酶，160微升/秒。细胞暴露于水解蛋白和胶原溶解分离试剂3分钟，175微升生长培养基应用，然后在160微升/秒，重复的数量表示研磨。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.典型的脂肪和成纤维细胞的iPSC集落的维护方案和一系列菌落密度的图像，以确定何时通路以保持有规律的馈送/通道循环。（A）与脂肪或成纤维细胞的96孔的iPSC集落准备通道开始，细胞的一列传代在机器人无需离心和稀释以12新列其中均在特定的时间间隔之后送入直到板准备再次通道。用于电池生产，不用于维持菌落列进行传代，并收集以供后续使用。任意数量的列可以传代，以控制扩张速率。 （B）中 ，以确定何时通路，一系列密度图像的捕获，每24小时被提供给用户。在顶部的红色框（在首次接种后72小时）的菌落不足够致密，通道和应喂。当密度相匹配的显示在绿色框（位于〜96小时），菌落是一个理想的密度通道。由120小时后，将菌落太密集到通道，应该避免这种情况。后者可与接种密度梯度，但常规培养在此密度强烈建议解决。白条等于200微米。 请点击此处查看大VERSI在这个数字的。
图4。96孔机器人培养系统允许用户从冷冻或活性的细胞系开始培养并执行播种梯度。（A）中的细胞溶液从冷冻细胞股票或收获的活性培养后由用户准备和放置在机器人上。机器人系统然后执行一个系列稀释协议来分发沿96孔板用通过柱分布密度梯度的初始细胞溶液。 （B - E）从四个十二列的细胞密度从A的实施例中，密度梯度播种协议之后48小时。白线等于225微米。 请点击此处查看本一个更大的版本图。
在96孔培养机器人图5多能性维持为脂肪和成纤维细胞衍生的iPSC系22（脂肪）或23（成纤维细胞）的通道（〜3个月）。（A - L）的脂肪和成纤维细胞衍生的iPSC细胞系是用机器人喂养并如在96孔板中的文字描述没有离心22或23的通道，然后固定和染色为多潜能标志物的Oct4，Nanog的，或SSEA4用DAPI复染传代。白条等于100微米。 （M - N），平行培养那些在一个被描述为提交显露的46条染色体正常补充染色体核型分析请点击此处查看大图ØF该数字。
图6.脂肪（96-A）和成纤维细胞（96-F），衍生的iPSC培养超过20代，在96孔的机器人格式维持多能性基因表达和分化成心肌细胞。总mRNA的从两个机器人培养iPSC系提取以及心肌从两行分化（CM-A =脂肪的iPSC衍生的心肌细胞，CM-F =成纤维细胞的iPSC衍生的心肌细胞，分化诱导后14天收集）和使用用于RT-PCR以探测多潜能标志物Nanog的，POU5F1，REX1，心肌标志物MYL7和装载控制GAPDH。人真皮成纤维细胞（HDF）也被收集和使用作为非iPSC的，非心肌细胞的控制。 请这里查看该图的放大版本。
图7.成纤维细胞和脂肪来源的iPS细胞维持长期96-机器人培养后分化成心肌细胞的能力（A - H）。脂肪和成纤维细胞的iPSC在超过20代的96孔机器人格式培养分化成心肌细胞。诱导分化后14天，96孔板结合的心肌细胞分离和再接种在低密度到玻片上肌钙蛋白T（红色），F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）的免疫染色。 请点击此处查看更大的版本这个数字。
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图8.向上扩展96孔板干细胞培养物。缩放干细胞产量可达取决于用于种子随后组板的板的数量。用户可以通过传代板数相同，在每个分割的机会或者维护一个生产水平或扩大生产播种多个板。例如，在周期0，1 96孔板进行传到12的新板（周期1），创建一个12倍的膨胀。此速率可被保持，如果12板之一是传代到新的一组十二个板（周期1到2）或传代多块板（周期2到3）展开。期间通道，可用于下游应用不用于维持菌落任何板。因此，传代12板经常可产生多达144板在两个通道：12，用于菌落维护和132用于其它用途。“>点击此处查看该图的放大版本。
图9.效率的96孔板基于培养细胞的生产大大超过人工栽培。如在图8所指出的，一个板可传代种子12板，然后可以传代至144板。膨胀的此速率可在两个分离的机会来实现。技术人员需要约3.5分钟喂1个6孔板，而他们花大约30秒一个96孔板来检查它放在显微镜，并将其放置在机器人。如果技术人员携带144板，他们将与机器人，而手动文化需要一个专用的8小时喂喂奶时花费约1.2小时处理板。 请点击此处到vIEW这个图的放大版本。
Discussion
在本研究中，我们开发了机器人文化的一部分，小型化和自动化饲养和通路在96孔板形式，同时也使有效规模起来的方法的iPSC生产。液体处理机器人被用来喂常规殖民地的iPSC和通过他们定期通过酶解。机器人还编程以产生细胞外基质凝胶包被的板并执行接种密度梯度。当成纤维细胞和脂肪来源的iPS细胞进行培养在本系统中为大于20代，约3个月，多能性维持，因为是稳定的核型。两种细胞系都能够分化成心肌细胞。一起，协议的这里所描述的集使用户用很少的干细胞培养的经验，或限制访问专门培养设备，培养的干细胞，并实现高电池产量或多行处理以最小的劳动和成本。
44,47 - 49保持多能性。而其他格式可扩展的干细胞培养的产量多能干细胞的20,23,29基于这种盘法，需要在文化本质的格式没有变化，就像适应停牌，使用消泡剂化学物质或长时间使用Rho激酶抑制剂20的。这种基于板的方法可以快速，因此，可预见的和，适应新的生产线，因为培养条件是相似的。由于使用iPS细胞用于疾病建模增加4,6,19,50，新的iPSC系不断产生。此处所描述的技术是最适合培养的新线在中到高容量和吞吐量，因为阻挡过渡到格式是升流。这也是真正的劳动和必要维持菌落设备。最后，因为格式和处理类似于用于推导和验证iPSC系，培养的性能，如定向分化的环境中，很可能是更可预测。
图8示出一种策略为干细胞的生产在96孔板向上扩展。一个板（周期0）用于机器人种子12的新板，一个12倍的增加（周期0到1）。后馈送的几天，十二板之一是传代种子的另一组12板（周期1到周期2）。剩余的11板是现在可用于其它用途，并代表该系统的生产成分。按照这个速度，一个板通道将提供11个板每个周期，或每3-4天。这种方法可以按比例更当多个板传代中所示的过渡从周期2到周期3在周期3，两个板都始终用来维持殖民地种子24个新盘。其余22板然后可对每个通道循环后使用。在维护周期的任何一点，用户可以种子多个板，以提高产量。一个例子是将通道的每一列两个生长周期。第一通道转换一个板成12片，并且每个12板被用于接种144板。在这种情况下，一个用户启动与一个板和两个通道，或约1.5-2周的培养之后，有144个板。例如，成纤维细胞和脂肪iPSC系产生每96孔板约25-75万个细胞时，准备通过。因此，144板可以代表约4-7×10 9细胞。
这是用于实现144 96孔板机器人的劳动负担？一对这项工作的目标是可扩展的干细胞的生产是降低了劳动相比传统（ 即 ，6孔板）干细胞培养物。该机器人ACComplishes这通过减少需要饲养和传代过程中，物理处理每个板。而96孔板生产规模直线状，将在传统的6孔板中，技术人员花费与板的工作时间是显著较少使用机器人培养。机器人培养的生产效率是从该差值（ 图9）导出。它被发现的技术人员可以从培养箱取出一个6孔板，检查它在显微镜，然后吸和饲料盘在约3.5分钟。相比较而言，技术人员花费约30秒除去96孔板从保温箱，并把它放在机器人之前在显微镜对密度和污染检查它。类似于上面所描述的扩展的馈送协议，六96孔板可以加载和进食，这需要大约21分钟，或每板3.5分钟。总的运行时间养活板相媲美的机器人之间IC和手动的方法，但要亲手喂6板技术人员需要的是所有21分钟，而技术人员只花费3分钟处理六大板块为机器人（每板30秒检查）。如图9所示，一个技术人员花费处理144板使用机器人的时间大约是1.2小时作为手动反对8小时，机器人将从来不会出错处理板或转移液体。
这里所描述的96孔的iPSC培养方法提供复杂的筛选任务的易于处理的平台。因为每个孔是遗传上相同，并接种在从相同的初始池相同的密度，可以将变量分布在板，并通过与市售的储层偏析条件机器人保持。这对于实验如干细胞生长培养基发育34,35,47，衬底或培养条件的测试和利用干细胞的毒性研究中是有用51。由于每个干细胞系是在最佳菌落大小和通道的要求而言唯一的，人们可以使用该系统通过操纵收获的列，通过期间的机械搅拌和进给频率调制接种密度，喂食次数通路的处理。通过这些变量的集合将会允许用户快速找到一套适合新行的培养条件或开发新的养殖技术。该机器人系统还能够保持96平行的，但独立的干细胞集落。当的iPSC衍生自体细胞或遗传操作之后克隆，许多平行的克隆进行筛选，以产生潜在iPSC系。一旦单个细胞接种到96孔板中，该系统可以进给和通道中的96孔板保持各菌落分离。这使得高产量潜力选择时，克隆并消除身体中培养96平行线的难度。这种方法也有llows扩大了生产的每一个克隆的，这样的材料很容易为平行分析。最后，我们设想结合用机器人板贩卖系统，可提供板到和从培养箱能够完全自动化培养这些培养技术。这可以实现更复杂的机器人，其允许更大的扩展，因为此处描述的基本协议转移到其它板的系统。
在协议地址的第一个关键步骤是那些防止和检查污染，如步骤1.5和4.2。污染，如上面所讨论的，可以成功地如果良好的无菌技术和常识被利用避免。它是必要的，无论干细胞培养的格式，即在指定的步骤的操作员检查污染和在这个协议中这样做将显著降低污染的风险。合适的细胞外基质凝胶申请是第二ESS的无穷区间步此协议的全面成功。没有适当涂覆的96孔板中，干细胞不会生长。一个常见的问题是不完整以及涂层。经验表明，气泡，静电引力和毛细作用阻碍完整良好的涂层。预润湿步骤（1.6）的开发是为了显著改善井底部涂层和不应该被跳过。该预湿润步骤出现减少的塑料96孔板的表观疏水使得当外基质凝胶涂层施加它被均匀地分布在井底部和侧面。此外，还建议轻轻敲击与干净的手涂一次，以保证均匀的细胞外基质凝胶溶液分布96孔板。解离的参数也很重要，以优化。用酶或EDTA基于解离试剂延长孵育将导致单个细胞可以或可以不通过期间的目标。因此，操作者应特别注意解离时间，研磨力，洗净重复是如何影响菌落形态和健康，并相应地调整。
理解的局限在这里所描述的技术是极为重要的操作成功。如在任何其他的细胞培养环境，使用96孔板的呈现一个相对高的污染的风险。如上所述，技术人员是饲养期间和传代处理每一板;例如，当打开盖子，把该板在机器人上的床，并检查板在显微镜。因此，步骤后1.5如前所述，当务之急是不要触摸任何板盖内或暴露这个部分的任何可能被污染的表面，如倾斜的加热块或垂直销在床上。在协议开发这一限制被发现，是推动制定一个机架容纳板盖保持无菌。同样，槽水库，枪头和邻疗法用品上的液体处理机器人床是潜在的污染源，因为它们是开放的环境以及由技术员处理。因此，良好的无菌技术应该被应用，如减少运动曝光过度培养材料或打开液体。另一个限制是，当协议被放大，目视确认的“100 96孔板每孔是麻烦的。这可通过视觉检查整个板污染的迹象，如混浊介质进行处理，以识别可疑的孔中。对于未来的规模时，使用自动显微镜和细胞生长和潜在的污染的指标将被引入。
总之，这里所描述的高通量的96孔平台提供了一个可重复的，高保真用于干细胞培养和生产的板形式的方法。这种方法减少了必要的经验，致力于干细胞培养，而设备和必要的劳动时间保持传统贴壁培养的好处。
Disclosures
作者MKC，MJG，EEB，NJD以及RO或曾在InvivoSciences的发展雇员，INC。其中设想和开发这里描述的机器人的协议的时间。 TW是对的CSO INC InvivoSciences。SH是吉尔森INC的员工。
Acknowledgments
这项工作已部分由美国国立卫生研究院资助，R44 GM087784和R01 HL109505的支持。作者感谢的技术和OEM团队吉尔森，INC延长的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped |
| Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
| Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96 tips D200 tips |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
| Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
| E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
| Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution |
| PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk |
| Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |
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