Introduction
Siden 1973 nyretransplantation model i mus har været et værdifuldt forskning værktøj, men tekniske problemer har hæmmet dens udbredte anvendelse. Gennem årene flere papirer er blevet offentliggjort detaljer forbedringer / justeringer af denne procedure. Som en model for primært vaskulariseret organtransplantation denne procedure er formentlig kun overgået af heterotopisk hjertetransplantation model, som også blev udtænkt af Russell laboratoriet i 1973 6. Begge modeller egner sig til forskning i allogene afvisning reaktioner, udvikling af forsinket transplantatfunktion og iskæmisk reperfusionsbeskadigelse.
En af de mest almindelige spørgsmål, der skal rapporteres med nyretransplantation er den relativt høje forekomst af arteriel trombose 4,5,7 som vi også har oplevet i vores laboratorium. Derfor satte vi os for at udføre en litteraturgennemgang af trombedannelse og eventuelt finde årsagen til dette tekniske spørgsmål, og at også udtænke enmulig løsning. Den mest sandsynlige årsag til thrombose er noget snoet bane blodet tager fra modtageren aorta, i donor renal aorta derefter til donorens nyrearterie. Denne vej bevirker turbulens i nyrearterien hvilket kan føre til blodpladeaktivering og trombedannelse. Baseret på de seneste observationer og en søgning af relevant litteratur 8-14 vi kom op med en ny teknik, der har reduceret trombose til 0%.
Den her beskrevne teknik varierer fra tidligere rapporterede teknikker i dannelsen af en arteriel hæl-tå-og manchet hvilke faciliteter forbedret blodgennemstrømningen og reducerer trombedannelse. Manchetten er dannet ved at dividere infra-renale aorta på tværs af forsiden af renal arteriel ostium i en vinkel mindre end 45 ° i forhold til længdeaksen af aorta (figur 1A & 1B). Dette resulterer i en manchet ca. 2 mm i længden. En venøs Carrel plaster dannes ved transecting renal vene i IVC derved øge diameteren af manchetten. Den infra-renale donor abdominale aorta hæl-og-tå manchetten ende-til-side anastomoseres til modtageren abdominale aorta og donorens nyrevene / IVC patch er ende-til-side anastomeres modtageren abdominal inferior vena cava (IVC) . Ureter indføres derpå i og forankret til blæren som beskrevet af Han et al 3.
Til denne undersøgelse ubehandlede transplantater med kun varm iskæmi gange (dvs., Ingen kolde iskæmi) sammenlignes. I dette tilfælde varm iskæmi henviser til den tid fra ophør af blodgennemstrømningen gennem donornyren (trin 1.11 nedenfor) og reperfusion af transplantatet i modtageren (trin 2.11 nedenfor). Kolde iskæmi refererer til det tidspunkt, hvor nyrerne ikke perfunderes og holdes på køl indtil begyndelsen af implantationsproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev købt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og blev opstaldet under patogenfrie betingelser ved University of Colorado Denver, Barbara Davis center Animal Facility ifølge NIH retningslinjer og med godkendelse fra University of Colorado Denver IACUC.
1. donornyren Harvest
- Sterilisere alle instrumenter, slid sterile handsker under hele proceduren og opretholde et sterilt felt. Udføre alle operationer med anvendelse af et operationsmikroskop.
- Kirurgisk fjerne musen donor nyrer fra pentobarbital-bedøvede (60 mg / kg IP) donorer. Fastslå dybden af anæstesi ved tå-knibe, og observere respirationsfrekvens.
- Clip pelsen så immobilisere musen ved 4-vejs begrænsninger. Forbered huden med povidon-jod og drapere musen i en steril måde.
- Lav en 2 cm midterlinjen lodret abdominal incision og indtast bughulen. Træk tarmen overlegent og eksternalisere detpå brystet. Hold tarmen indpakket i steril fugtig gaze hele proceduren.
- Identificer de store abdominale kar og mobilisere dem, identificere eventuelle lænde grene og enten ætse eller ligere dem med 10/0 nylon sutur.
- Umiddelbart distalt til den venstre nyrekar drille inferior vena cava (IVC) og abdominale aorta (AA) fra hinanden ved stump dissektion i løbet af ca. 2 mm. Liger med 10/0 nylon og dele små arterielle og venøse grene fra de renale kar.
- Nu adskille nyrevenen fra nyrearterie forsigtigt ved stump dissektion af disse strukturer. Dette giver mulighed for nøjagtig oprettelse af et Carrel plaster ved den proximale ende af den renale vene, som vil blive anvendt til at danne en ende-til-side anastomose til modtagerne IVC.
- Identificere, Liger og deler den venstre binyre fartøjer. Dette tillader adgang til suprarenale aorta og en 6-0 silkesutur placeres rundt om aorta under forberedelse til ligering, men ikke bundet på dette tidspunkt. Mobilisere nyre, skibe og urinlederen fra det omgivende facia. Drej nyrerne til højre og liger / opdele eventuelle posteriore grene. Derefter returnere nyrerne til venstre.
- Nu henlede opmærksomheden på ureter. Uden at forstyrre den renale hilum frigøre urinlederen fra den omgivende facia tage sig at bevare ureteric fartøjer. Opdele ureter på niveauet af ductus deferens. Nyrerne er nu klar til at inddrive.
- Langsomt injicere 300 enheder af heparin ind i den distale IVC derved heparinizing donoren. Binde 6-0 silkesutur placeret omkring suprarenale AA og perfundere venstre nyre via den distale abdominale aorta med 0,8 ml af heparin saltvandsopløsning (100 U / ml).
- Når perfusionen er ophørt skabe en venøs Carrel patch straks at fjerne tilbagestrømning ind i nyren. Træk den renale vene mod nyren afslører AA og nyrearterie nedenunder.
- Opdele aorta støder op til nyrearterien skabe en hæl oge manchetten som vist i figur 1. Fjern nyrerne, skibe og urinlederen fra donoren.
- Fjern nyrerne direkte til en forud fremstillet modtager (0 min kolde iskæmi tid) eller opbevares ved 4 ° C i en opløsning af valg for en forudbestemt tid, indtil implantationstidspunktet. Aflivet donorerne exsanguanation og cervikal dislokation. Samlet tid til at komme sig donor nyre er ca.. 15-20 min.
2. Nyre implanteringsteknik
- Bedøver modtageren mus med pentobarbital (60 mg / kg IP initialdosis, 25 mg / kg IP supplerende dosis, hvis det kræves). Fastslå dybden af anæstesi ved tå-knibe, og observere respirationsfrekvens. Clip pelsen derefter immobilisere musen ved 4-vejs begrænsninger og anvende oftalmologiske salve til øjnene. Forbered huden med povidon-jod og drapere musen i en steril måde.
- Lav en 2 cm midterlinjen lodret abdominal incision og indtast bughulen. Træk tarmenoverlegent og eksternalisere på brystet. Hold tarmen indpakket i steril fugtig gaze hele proceduren.
- På dette tidspunkt udfører en ret nefrektomi. Ligere nyrearterie og vene med 6-0 silkesuturer. Udskære nyrerne distalt suturerne. Ligere ureter med 6-0 silke og derefter dividere proximalt til nyren.
- Isoler den abdominale aorta og inferior vena cava (IVC) under nyrekar. Placer 4-0 bomuld bånd rundt om aorta og IVC overlegen derefter ringere end anastomosen webstedet. Identificere og ligere eventuelle lumbal fartøjer inden med 10-0 nylon sutur.
- Bind bomuld bånd, først ringere, efterfulgt af den overlegne. På denne måde noget blod tilbageholdes i aorta gør aortotomy lettere.
- Danne aortotomy med en 30G nål til at indtaste lumen af aorta. Forlæng snittet med fine mikro saks til en længde på ca. 2 mm.
- Gøre en ende på side anastomose af donor aorta hæl-og-tå manchet tilmodtageren aorta på følgende måde. Placer en 10-0 nylon sutur ophold sting i donor aorta og den ringere vinkel snit i modtagerens aorta og slips.
- Placer en anden 10-0 nylon modsat den første i donor aorta og den overlegne hjørne af snit i den abdominale aorta og slips. Foretag en løbende sutur linje fra overlegen ringere i den laterale væg af aorta og binde mod tidligere placeret ophold søm. Så sutur den mediale væg i en kørende mode og slips.
- Gøre en ende på anastomose af donor nyrevene til modtageren IVC på følgende måde. Punktere IVC med en 30G nål og udvide snit med fine mikro saks. Bind donor nyrevene til ringere hjørne af snit i IVC med 10-0 nylon. Lav en kørende sutur linje mellem den renale vene og IVC og slips.
BEMÆRK: Det er også meget vigtigt, at fuld tykkelse passerer af Suturnåle herunder vaskulære adventitIA og intima opnås. Udkrængning af kanterne sikrer også, at der er intima-til-intima kontakt, som hjælper med tætning og heling af anastomoser. Mens en hæmostatisk evne til at størkne agent kan være nyttig til at reducere lækager, anbefaler vi, at en kirurg i stedet stole på god teknik. - Sørg for, at anastomoser er "ren". Det vil sige, at de modstående vægge ikke bliver fanget, når du placerer sting. Dette vil medføre en betydelig indsnævring til at flyde, som vil resultere i et mislykket graft og i ekstreme tilfælde til bagbensparalyse.
BEMÆRK: En anden afgørende vigtig faktor er at sikre, at spændingen i det anastomotiske suturlinjer er også optimal. For løs og der vil være uoprettelige lækker, alt for stram og forsnævring at flyde vil medføre. Hvis på den arterielle side dette vil resultere i dårlig perfusion af transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet nyre vil medføre. - Slip distale 4-0 bomuld slips genindførelse venøse flow. Når hæmostase i venoos anastomose er gradvist blevet observeret løsne proksimale 4-0 bomuld slips og observere den arterielle anastomose til hæmostase.
- Fjern bomuld bånd fra musen, når begge anastomoser betragtes sikker. Pierce blæren med en 20 G nål skaber to huller.
- Pass spidserne af buede pincet gennem hullerne og træk donor ureter gennem blæren med pincet med den proximale ende af ureter er forankret på blærevæggen med to 10-0 nylonsuturer. Trim overskydende længde ureter rager ud fra det andet hul tillader ureter at trække i blæren og lukke hullet med to 10-0 nylonsuturer.
- Retur tarmen til maven. Luk bugvæggen i to lag ved hjælp af 5-0 silkesutur i et kørende måde.
- Administrere en 1,0 ml bolus sterilt, varm normalt saltvand i maven som væske genoplivning ved lukning og injicere 0,8 ml normalt saltvand subkutant postoperativt. Ingen anden supportive foranstaltninger er nødvendige under operationen.
- Gendan dyret på en opvarmning tæppe. Total implantat er ca.. 35-45 min. Administrere analgetika, såsom buprenorphin, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml i begyndelsen af proceduren og hver 6-12 timer i 72 timer efter operationen.
3. Kontralateral nephrectomi
- Afhængig af protokol krav, flere dage efter implantatet procedure, udføre en kontralateral nefrektomi under isofluran anæstesi (5% inhaleret isofluran til induktion, 1,5-2,0% for vedligeholdelse).
- Indtast bughulen og forsigtigt trække tarmen til dyrets højre. Udsætte venstre nyre og stumpe dissekere fra de omkringliggende fascia.
- Ligere nyrearterie, vene og ureter med 6-0 silkesuturer og derefter udskære nyrerne ovenfor suturerne og fjern nyrerne. Total operativ tid er ca.. 10 min.
4. Graft Assessment
- Mål serum creatini anvendelse af den alkaliske picrat metoden (Jaffe reaktion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne kirurgisk teknik muliggør enten simple transplantatoverlevelse / afvisning undersøgelser, eller ganske komplekse forsøgsprotokoller. I figurerne nedenfor har vi demonstrere fordelene ved at bruge denne forbedrede arteriel anastomose teknik. Ved hjælp af denne teknik, som vi har reduceret forekomsten af arteriel thrombose fra 35% til 0% og dermed øge produktiviteten. Vi har anvendt denne teknik i over et år med samme 0% trombose resultat fastholdes. Figur 1 beskriver fremgangsmåden til dannelse af det arterielle hæl-tå-og manchet, som er grundlaget for denne nye teknik. Denne manchet giver en længere anastomose og en mere lige blodgennemstrømning vej ind i nyren. Begge disse punkter resultere i væsentligt mindsket turbulens og derved reducere sandsynligheden for blodpladeaktivering og trombedannelse.
Figur 2. immunhistokemisk analyse. (A) Periodiske Acid-Schiff farvede del af en kontrol ikke-transplanted nyre. (B) A syngene nyretransplantation på POD 8 ved hjælp af reviderede teknik viser normale proximale tubulære celler, der er terningformet med en klar cytoplasma og en rund lys kerne i midten af cellen. Der er tegn på mild børste grænserne skade (pile), men de fleste af børste grænser er regelmæssig og velbevaret. Forstørrelse: 400x.
Tabel 1. Sammenligning af trombose forekomst og varme iskæmi gange mellem de to teknikker. Er alle værdier udtrykt som middelværdi ± SD. For enlige sammenligninger, er normalfordelte data evalueres under anvendelse uparrede, tohalede Student t-tests, og ikke-normalfordelte data analyseres af parametrisk uparrede Mann-Whitney U test. P-værdier på mindre end 0,05 anses for statistisk significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mastering denne transplantation teknik er svært, men når udført det er et meget kraftfuldt forskning værktøj. Patienten kirurg / forsker vil blive belønnet med sans for detaljer og sammenhæng i teknik, som er nøglen til at beherske enhver kirurgisk procedure, endnu mere i små dyremodeller. De tekniske vanskeligheder ved at beherske musen nyretransplantation er mange folder, og det er meget sandsynligt, at erfaring i andre små dyr transplantation modeller skal opnås før at tackle denne procedure.
Det er vigtigt at sikre, at anastomoser er "ren", dvs., de modstående vaskulære vægge skal ikke blive fanget, når placere sømme med henblik på at opretholde et patent lumen. Ellers vil der være en betydelig indsnævring til at flyde, der vil mere end sandsynligt resultere i et mislykket transplantat og i ekstreme tilfælde føre til hind-lemmer lammelse. Det er også af afgørende betydning, at fuld tykkelse passerer af suturnål herunder vaskulære adventitia og intima opnås da dette resulterer i korrekt evertion af kanterne sikre, at der er intima-til-intima kontakt, som hjælper med tætning og heling af anastomoser. Mens en hæmostatisk evne til at størkne agent kan være nyttig til at reducere lækager, anbefaler vi, at en kirurg i stedet stole på god teknik.
Også opmærksomheden skal rettes mod at sikre spændingen i de anastomotiske suturlinjer er optimal, for løs, og der vil være uoprettelige lækker, til stram og reduceret flow vil medføre. Hvis på den arterielle side dette vil resultere i dårlig perfusion af transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet nyre vil medføre. Nå dette korrekte spænding er et spørgsmål om praksis og erfaring med andre små dyr mikrovaskulære modeller vil være til stor hjælp. Frem for alt konsistens teknik og urokkelig sans for detaljer vil give fremragende mus og graftoverlevelse, og nyretransplantation funktion.
t "> Begrænsningerne af denne teknik er kun omfattet af de anvendelser, som kan anvendes af investigator. Som med enhver mikrovaskulære procedure, så længe god teknik observeres resultaterne skal være reproducerbare.Forekomsten af arteriel thrombose ved anvendelse af denne teknik er blevet drastisk reduceret. Dette resulterer i mindst 1/3 af alle nyretransplantationer konverteres fra potentielle tekniske fejl til brugbare data, hvilket resulterer i reducerede omkostninger og øget produktivitet.
Som et fuldt vaskulariseret, ortotopisk transplantation model de fremtidige ansøgninger vil omfatte afvisning / tolerance undersøgelser, fænomenet forsinket transplantatfunktion og undersøgelser mekanismerne i iskæmi / reperfusion skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
