絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
質量分析（MS）を使用してプロテオーム実験は、非標的（ショットガン）または標的化方法のいずれかを使用するように設計することができます。ディスカバリープロテオミクスは、一般的に、従来のデータ依存取得モードを使用することによって、または（ 例えば 、MS E、SWATH）最近開発されたデータに依存しない技術の一つ1,2を用いてのいずれかで、ボトムアップショットガンMSに依存しています。ショットガンプロテオミクスは、ハイスループットペプチド同定および相対定量のための強力なツールですが、それは絶対的な定量化のための、またはタンパク質の小、定義されたセット（〜数十）を標的とするため、一般的に不適切です。最も頻繁に使用される標的プロテオミクスMS法は、その高い感度、速度、およびダイナミックレンジ3-5の反応モニタリング（SRM）が選択されます。 SRMの代替は、高解像度、フルMSスキャン6を活用し、並列反応モニタリングを含みます。
SRMは、通常は、ナノフローreverを使用して実行されますトリプル四重極質量分析計（QQQ-MS）に取り付けられたナノエレクトロスプレーイオン化（ナノESI）イオン源に結合されたsedの相高速液体クロマトグラフィー（ナノRP-LC）装置。典型的な実験では、サンプルのタンパク質をタンパク質分解的に消化され、得られたペプチドは、クロマトグラフィー分離脱着およびイオン化されます。得られた前駆体イオンは、衝突ガスでそれらを衝突させて第二の四重極（Q2）の最初の四重極（Q1）によってフィルタリングされ、断片化されたm / zです。得られたフラグメントイオンであるのm / z濾過第四重極（Q3）及びダイノードによって定量しました。各前駆体およびフラグメントイオン対は、遷移と呼ばれ、各遷移が指定された期間（滞留時間、通常は2~50ミリ秒）のために監視されます。 LC-SRM中、QQQ-MSサイクル遷移の事前定義されたリストを（デューティサイクルは、典型的に≤3秒）であり、各遷移のクロマトグラムが生成されます。
代替strategタンパク質定量のためのIEは、典型的には、ドットブロット、ウェスタンブロット、ELISA法、抗体マイクロアレイ、逆相タンパク質マイクロアレイ、マイクロ流体イムノアッセイ、デジタルELISA法、およびマイクロスフェアベースのイムノアッセイ7などのイムノアッセイを使用しています。最高のイムノアッセイは、LC-SRMよりも著しく敏感であることができ、イムノアッセイのサンプルスループットLC-SRM 5のそれよりも有意に高くすることができます。しかし、開発イムノアッセイは高価なことができ、および/ または時間がかかり、結果として得られるアッセイは、細胞/組織溶解/均質化法との互換性がない、交差反応性および/ または干渉を受けやすいことができ、および/ または適していない5,8を多重します。これらの問題のいくつかは、抗体とMSベースの技術を結合することによって対処することができます。例えば、標的タンパク質は、タンパク質分解の前及びLC-SRM 9-12に免疫沈降を使用して濃縮することができます。あるいは、SISCAPA技術は、ペプチドLEVEでタンパク質分解に続いて免疫沈降を採用しますL 13,14。 immunoenrichment戦略に加えて、高存在量タンパク質の免疫除去は、分析物15,16を共溶出することにより干渉を低減することにより、LC-SRMの感度を高めるために使用することができます。
MSベースのタンパク質定量は、相対および絶対定量に分割し、また、ラベルフリーと安定同位体標識（ 例えば 、代謝標識、化学標識、および重標識されたタンパク質およびペプチド内部標準）にすることができます。ラベルフリー技術は、相対的なタンパク質定量のために有用であるが、正確な絶対定量には適していないことができます。比較すると、標識技術は、試料調製及びMSの分散に関連する誤差を低減しており、多くの場合、相対的タンパク質定量17のために使用されます。例えば、安定同位体標識されたプロテオーム（SILAP）規格は、ヒト血清18のLC-SRMを介して、潜在的なバイオマーカーの相対的定量化を可能にし、培養ヒト細胞株を用いて調製し。 MSによる正確な絶対的なタンパク質定量は、精製、定量化し、同位体で標識されたタンパク質またはペプチド内部標準をスパイク-にすることは、MSの前に生物学的サンプルが必要です。 LC-SRMワークフローへの重い同位体で標識された内部標準の組み込みは、高い再現性と実験室16,19の間で譲渡することが示されている絶対的定量を可能にします。
MSによる絶対的なタンパク質定量のための安定同位体標識された内部標準ペプチドの基準は、固相合成20、連結されたプロテアーゼ切断可能なペプチド標準21、および全長タンパク質標準22からなるタンパク質を用いて調製が含まれます。標的タンパク質の共有結合修飾と不完全な試料調製（ すなわち 、不完全なサンプル溶解および均質化し、不完全なタンパク質の可溶化、変性、アルキル化、およびタンパク質分解）が正確な定量を弱体化させることができます。内部Protein基準は、これらの潜在的な問題の多くによって影響される可能性が最も低いですが、彼らは通常、準備するのが最も困難です。代替的には、アミノ末端およびカルボキシ末端の天然のフランキング残基を含むように設計された複数の内部ペプチド標準を使用して、各標的タンパク質を分析することです。かかわらず、内部標準のタイプが使用されるのは、スパイク、にすべきである生物学的サンプルとして早期にできるだけ試料調製中。また、複数のサンプル調製技術（ 例えば 、異なる変性条件）をテストする必要があります。複数の直交実験技術（実験クロスバリデーション）の使用量は、23〜25に挑戦する最も可能性の定量化を克服するための実行可能な戦略です。
タンパク質のLC-SRMの定量化は、多種多様な用途で使用されてきた非常に柔軟な技術です。特に、それは内のペプチド及びタンパク質バイオマーカーを研究するために使用されています例えば、血清、コア生検、および微細針吸引物5として臨床サンプル。 LC-SRMはまた、ボツリヌス神経毒27を検出するためにシグナル伝達経路5内タンパク質のリン酸化の動態を定量化するために、およびタンパク質構造28の変化を定量化するために、タンパク質複合体5,26の化学量論を測定するために使用されてきました。
私たちの研究室では、走化性経路シミュレーションの開発を支援するマクロファージ走化性を媒介するシグナル伝達タンパク質を定量化するために、LC-SRMを使用しています。プロトコル（ 図1）の全体的なスキームは、仮の目標ペプチドをランク付けすることから始まります。次いで、粗製の外部ペプチド標準を合成し、生物学的サンプルの定性分析のためにLC-SRMアッセイを開発するために使用されます。生体試料由来の標的ペプチドを検出した場合、精製された重標識ペプチド内部標準は、定量的LC-SRMのために調製されます。このプロトコルは、交流を使用することができcurately生物学的サンプルの様々なからのタンパク質を定量し、タンパク質標的の多様な研究を支援します。
Protocol
Representative Results
Discussion
絶対的なタンパク質定量は、バイオマーカーの検証とシグナル伝達経路のモデリングとして生物医学的用途の非常に多様な範囲のために不可欠です。最近では、LC-SRMを使用して標的プロテオミクスは、ペプチド標準品、HPLC、QQQ-MS、およびLC-SRMデータ解析を含む多数の技術の改善の恩恵を受けています。したがって、イムノアッセイへの強力な代替となっています。イムノアッセイは、多重化…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
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