Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Experimentos proteómicos que utilizan espectrometría de masas (MS) se pueden diseñar para utilizar ya sea no específica (shotgun) o métodos específicos. Proteómica Descubrimiento generalmente se basa en la escopeta de abajo hacia arriba MS, ya sea mediante el uso de un modo de adquisición de datos dependiente tradicional, o utilizando una de las técnicas de datos independiente de reciente desarrollo (por ejemplo, MS E, SWATH) 1,2. Proteómica de escopeta es una poderosa herramienta para la identificación de péptidos de alto rendimiento y la cuantificación relativa, pero es generalmente inadecuado para la cuantificación absoluta o para dirigir pequeños conjuntos, definidos (~ decenas) de las proteínas. El método MS más utilizado para la proteómica dirigidos se selecciona reacción monitoreo (SRM) debido a su alta sensibilidad, velocidad y rango dinámico 3-5. Alternativas a SRM incluyen el monitoreo de reacción en paralelo, que se aprovecha de alta resolución, escaneo de MS total de 6.
SRM se realiza generalmente mediante un rever nano-flujocromatografía SED-fase líquida de alto rendimiento (nano-RP-LC) acoplada a un instrumento de ionización por electrospray nano-(nano-ESI) fuente de iones unido a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ-MS). En un experimento típico, las proteínas de la muestra se digiere proteolíticamente, y los péptidos resultantes se separaron cromatográficamente, desorbidos, y ionizados. Los iones precursores resultantes son m / z filtrada por el primer cuadrupolo (Q1) y fragmentado en el segundo cuadrupolo (q2) al chocar con un gas de colisión. Los iones de fragmentos resultantes son m / z-filtrada en la tercera cuadrupolo (Q3) y se cuantifica por un dynode. Cada par precursor y el ion fragmento se conoce como una transición, y cada transición se controla por un período determinado de tiempo (el tiempo de permanencia; típicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, los ciclos QqQ-MS a través de una lista predefinida de transiciones (el ciclo de trabajo es típicamente ≤3 seg), y se produce un cromatograma de cada transición.
Strateg Alternativas para la cuantificación de proteínas suelen utilizar inmunoensayos tales como transferencias de puntos, transferencias de Western, ELISA, microarrays de anticuerpos, microarrays de proteínas de fase inversa, inmunoensayos de microfluidos, ELISA digitales, e inmunoensayos basados en microesferas 7. Los mejores inmunoensayos pueden ser significativamente más sensible que la LC-SRM, y rendimiento de la muestra de inmunoensayos pueden ser significativamente mayor que la de LC-SRM 5. Sin embargo, los inmunoensayos en desarrollo pueden ser costosos y / o requiere mucho tiempo, y los ensayos resultantes pueden ser vulnerables a la reactividad cruzada y / o interferencia, incompatible con la célula / tejido de lisis / métodos de homogeneización, y / o no susceptible de multiplexación 5,8. Algunos de estos problemas pueden abordarse mediante el acoplamiento de técnicas en anticuerpos y basados en MS. Por ejemplo, las proteínas diana pueden enriquecerse utilizando inmunoprecipitación antes de la proteólisis y LC-SRM 9-12. Alternativamente, la técnica emplea SISCAPA inmunoprecipitación posterior a la proteólisis en el péptido level 13,14. Además de immunoenrichment estrategias, immunodepletion de las proteínas de alta abundancia puede ser empleado para aumentar la sensibilidad LC-SRM mediante la reducción de la interferencia por coeluyentes analitos 15,16.
La cuantificación de proteínas basado en MS se puede dividir en la cuantificación relativa y absoluta, y también en el etiquetado de isótopos de etiqueta libre y estable (por ejemplo, etiquetado metabólico, etiquetado química, y de la proteína marcada con pesado y de péptidos estándares internos). Técnicas de la etiqueta libre pueden ser útiles para la cuantificación de proteínas relativo, pero no son adecuados para la cuantificación absoluta precisión. En comparación, las técnicas de etiquetado han reducido de error asociado con la preparación de muestras y MS varianza, y se utilizan a menudo para la cuantificación relativa de proteínas 17. Por ejemplo, isótopo estable marcado proteoma normas (SILAP) preparado utilizando una línea celular humana se cultivaron permitido la cuantificación relativa de biomarcadores potenciales a través de LC-SRM de suero humano 18. Precisa cuantificación de proteínas absoluta por la EM requiere que las normas internas, cuantificado, proteína o péptido marcado isotópicamente purificada y se enriquecerán-en muestras biológicas antes de la EM. La incorporación de isótopo pesado estándares internos marcados en un flujo de trabajo LC-SRM permite la cuantificación absoluta que se ha demostrado ser altamente reproducible y transferible entre los laboratorios 16,19.
Isótopos estables etiquetados normas internas para la cuantificación absoluta de proteínas por MS incluyen normas de péptidos preparados mediante síntesis en fase sólida 20, proteínas compuestas de normas péptido proteasa escindible concatenados 21, y las normas de la proteína de longitud completa 22. Target modificación covalente de proteínas y preparación de la muestra incompleta (es decir, la lisis incompleta de la muestra y de la homogeneización, y la solubilización incompleta de proteínas, la desnaturalización, la alquilación, y la proteolisis) puede socavar la cuantificación exacta. P Internanormas rotein son los menos propensos a ser afectados por la mayor parte de estos problemas potenciales, pero por lo general son los más difíciles de preparar. Una alternativa es analizar cada proteína diana utilizando múltiples estándares de péptidos internos que están diseñados para incluir residuos flanqueantes nativas amino- y carboxi-terminal. Independientemente de que se emplea el tipo de patrón interno, se debe claveteado-en las muestras biológicas en un punto temprano como durante la preparación de la muestra como sea posible. Además, las técnicas de preparación de muestras múltiples (por ejemplo, diferentes condiciones de desnaturalización) deben ser probados. El uso de múltiples técnicas experimentales ortogonales (experimental de validación cruzada) es una estrategia viable para superar la mayor cuantificación potencial desafía 23-25.
LC-SRM cuantificación de proteínas es una técnica altamente flexible que se ha utilizado en una amplia variedad de aplicaciones. En particular, se ha utilizado para estudiar péptidos y proteínas dentro de biomarcadoresmuestras clínicas tales como suero, biopsias de núcleo, y aspirados con aguja fina 5. LC-SRM también se ha utilizado para medir la estequiometría de los complejos de proteínas 5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas 27, para cuantificar la dinámica de fosforilación de proteínas dentro de las vías de señalización 5, y para cuantificar los cambios en la conformación de la proteína 28.
Nuestro laboratorio está utilizando LC-SRM para cuantificar las proteínas de señalización que median la quimiotaxis de macrófagos para apoyar el desarrollo de simulaciones vía quimiotaxis. El esquema general del protocolo (Figura 1) comienza con la clasificación de los péptidos diana tentativas. Posteriormente, los estándares de péptidos externos crudo se sintetizan y se utilizan para desarrollar ensayos LC-SRM para los análisis cualitativos de muestras biológicas. Si se detecta el péptido diana derivado de muestra biológica, los estándares de péptido interno marcado con pesados purificados se preparan para cuantitativo LC-SRM. Este protocolo se puede utilizar para accurately cuantificar proteínas a partir de una amplia variedad de muestras biológicas, y para apoyar las investigaciones de una amplia variedad de dianas proteicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuantificación de proteínas absoluta es esencial para una gama muy diversa de aplicaciones biomédicas como la validación de biomarcadores y el modelado vía de transducción de señales. Recientemente, la proteómica dirigidos utilizando LC-SRM se ha beneficiado de las mejoras a las numerosas tecnologías, incluyendo la preparación de péptidos estándar, HPLC, QqQ-MS, y el análisis de datos LC-SRM. En consecuencia, se ha convertido en una alternativa poderosa para inmunoensayos. Los inmunoensayos pueden ser extre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
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