מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (<em> Aeruginosa Microcystis</em>) שימוש cytometry הזרימה
Summary
אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.
Abstract
תת-אוכלוסיות חיידקים במחקרי שדה ומעבדה הוכחו להציג גבוהה ההטרוגניות בפרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים. קביעת המצב בזמן אמת של תא חיידקים חורג קטגוריות חיות או מתות, כחיידקים יכולים להתקיים במצב רדום, לפי חלוקת תאים ופעילות מטבולית מופחתות. בהתחשב בצורך באיתור וכימות של חיידקים, cytometry זרימה (FCM) עם בדיקות מולקולריות מספקת שיטה מהירה ומדויקת כדי לקבוע את הכדאיות אוכלוסייה כללית. באמצעות Sytox הירוק וSytox אורנג 'כבחוליות מודל Microcystis aeruginosa לזהות שלמות קרום, אנו מפתחים שיטה להעברה לאינדיקציה מהירה של תמותת תא בודדת. הבדיקות מולקולריות המשמשות בכתב עת זה תופנה לבדיקות חומצות גרעין ירוקות או כתומות כבהתאמה (אם כי יש מוצרים אחרים עם אורכי גל עירור ופליטה דומים שיש לי מצבים דומים כיצד תפעלn, אנו מתייחסים באופן ספציפי לקדמת הבמה ציינו בדיקות). פרוטוקולים באמצעות בדיקות מולקולריות להשתנות בין מינים, שונים בעיקר בזמני ריכוז ודגירה. בעקבות פרוטוקול זה יצא לM.aeruginosa הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הייתה מותאמת בריכוזים של 0.5 מיקרומטר לאחר 30 דקות של דגירה והבדיקה הכתומה חומצות הגרעין במיקרומטר 1 לאחר 10 דקות. בשני ריכוזי הבדיקות פחות מאופטימלית האמור הוביל לתחת דיווח של תאים עם נזק קרום. לעומת זאת, 5 מיקרומטר ריכוזים וגבוהים בשתי הבדיקות הפגינו סוג של כתמים שאינם ספציפיים, לפיה תאים "חיים" המיוצרים על הקרינה יעד, שמוביל לייצוג יתר של מספרים סלולריים "שאינם בר-קיימא". הבקרות החיוביות (-נהרג חום) הניתנות ביומסה המתה הניתנת לבדיקה, אם כי ההתאמה של דור שליטה נשארת נושא לדיון. על ידי הוכחת רצף הגיוני של צעדים לייעול הבדיקות הירוקות וכתומות חומצות גרעין אנחנו דהmonstrate כיצד ליצור פרוטוקול שניתן להשתמש כדי לנתח מצב פיסיולוגי cyanobacterial ביעילות.
Introduction
התא הוא מערכת מורכבת, שמגיבה כל הזמן לסביבה על ידי שינוי פרמטרים פיסיולוגיים ולשנות את תפקודו. הדינמיקה של אוכלוסיות חיידקי אוכלוסיית isogenic הן בטבע והמעבדה מושפעות מההתפתחות של תת-אוכלוסיות, המתרחשת גם בתנאים סביבתיים קבועים יחסית 1 – 3. ההשתנות של קהילות חיידקים טבעיות מתעוררת בשל האופי משתנה מאוד של תנאים סביבתיים. תהליכים סטוכסטיים לפעמים אלה לאחר מכן לייצר תת-אוכלוסיות ששונות מאוד לממוצע האוכלוסייה. העדויות אחרונות גילו כי תת-אוכלוסיות הפיזיולוגיות אלה מגיבות באופן שונה לתנאי סביבה ויכולות לייצר תרכובות אות או מעכבים שלהשפיע באופן דרמטי ולהשפיע על 3,4 האוכלוסייה הכללית.
הקמת שיטה להגדיר ההטרוגניות באוכלוסייה היא מפתח להאו"םderstanding האקולוגיה של חיידקים בסביבות שונות וחיוני בעת בניית ידע של כחוליות מטרד, כגון Microcystis הרעיל, אשר משפיע במידה רבה על ביטחון מים אנושי. מין כגון Anabaena להציג ההטרוגניות מורפולוגיים בתגובה לתנודות סביבתיות, פיתוח תאים מיוחדים כמו heterocysts וakinetes 2. לעומת זאת, תאי Microcystis לא להציג ההטרוגניות מורפולוגיים ברורה בתגובה ללחץ. האפליה בין תאי קיימא ולא ברי-קיימא היא ההיבט החשוב ביותר של בידול פיסיולוגי ומאפשרת הבנה טובה יותר של דינמיקה של אוכלוסיות חיידקים. עם זאת, הבעיה הרעיונית של כדאיות חיידקים עצמו עדיין קשה ומאופיין 1,5,6 גרוע.
Cytometry זרימה (FCM) הוא שיטה אמינה ומהירה של ניתוח תאים בודדים. כדי להגביר את ההבנה של פיזיו תא הבודדמשעמם בFCM, בדיקות מולקולריות שימשו להבחין מספר חילוף החומרים והתהליכים ביוכימיים 7. זה הוביל לידע מוגבר של מינים ברמה תאית ואוכלוסייה בתורו עזר ניהול משאבי מים 8,9. עם זאת, אורגניזמים שונים במונחים של ספיגת בדיקה מולקולרית וזרימה בגלל הנקבוביות והמשאבות בקירות וקרומים תאיים, שהובילו למספר עיצוב בדיקה המולקולרי ויישום פרוטוקול 6,10,11. בדיקות מולקולריות זמינות למטרות מסחריות ומחקר לעתים קרובות מסופקות עם פרוטוקול גנרי אשר עשוי להיות רלוונטיות לסוג תאים שונה מאוד. אחד חייב להיות זהיר מאוד בהעברת פרוטוקולים שפותחו עבור סוג תא אחד עד 6 אחר, על כן משימה חיונית כדי לייעל את הבדיקות מולקולריות ביעילות לפני השימוש.
בדיקות חומצות גרעין הירוקות וכתומות להיקשר לשתי חומצות גרעין פעמיים התקועות ויחידות עם בסיס מינימאלי בחרivity ומשמש להעריך את שלמות קרום פלזמה של תאים. יש הבדיקה חומצות הגרעין הירוקה אות הקרינה תיוג התא השתפרה במידה ניכרת בהשוואה לבדיקות אחרות מולקולריות, כגון תרכובות המבוסס יודיד propidium 12, שיכול לשמש גם חיווי של כדאיות תא. "כדאיות התא" המונח כאן מניחה ששפלת DNA מתרחשת לאחר אובדן שלמות קרום פלזמה. בדיקות חומצות הגרעין הן צבעי cyanine סימטריים עם שלושה מטענים חיוביים ולא יכולות להיכנס לתאים וקרומים תחת ריכוזים מאופיינים, בשני 11,13 ופרוקריוטים 14,15 אורגניזמים האיקריוטים. הכריכה של בדיקה חומצת גרעין לחומצות גרעין יכולה לגרום לגידול של פי> 500 של פליטת הקרינה מאותות אנדוגני בתאים שיש להם שלמות הקרום בסכנה. למרות שבדיקות מולקולריות כגון הבדיקה חומצות גרעין הירוקה יכולות להיות אינדיקטור טוב של פיזיולוגיה של תא בודד, יש צורך לאo לייעל כל בדיקה עם אורגניזם המטרה המיועד, כפעמי דגירה שנעו בין 7 דק '- 30 דק' וטווחי ריכוז מ0.1 מיקרומטר – 0.5 מיקרומטר בניסויי Microcystis לבד 15-19.
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לייעל את מבחני cytometric של ירוק ובדיקות החדשות יחסית כתומות חומצות הגרעין (שעד כה לא נבדקו על מיני cyanobacterial M.aeruginosa). מתודולוגיה המפותחת הבאה לאחר מכן ניתן להעביר למינים אחרים ומשמשת כפלטפורמה לייעול פרוטוקולים בבדיקות מולקולריות אחרות, ובכך להגדיל את ההבנה של חיידקים וההתנהגות האקולוגית שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המספרים מוגברים של פרסומים באמצעות בדיקות מולקולריות מציין שניתן להשיג נתונים אמינות ואינפורמטיבי 5,6,8 – 15,19,22,23. כמו של עוד אין כתם מושלם לכדאיויות תא שיכול להיות יעיל בכל המינים באותה עת ריכוז ודגירת 6,10. אפילו אותו הסוג של בדיקה עם פליטת הקרינ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר דוקטורנט דייב הרטנל ואוניברסיטת בורנמות לתמיכה ומימון למחקר ומתקנים.
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
Referências
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?. J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
