Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico (<em> Microcystis aeruginosa</em>) In citometria a flusso

Summary

Popolazioni microbiche contengono eterogeneità delle cellule sostanziale, che può dettare il comportamento generale. Analisi della sonda molecolare attraverso citometria a flusso in grado di determinare stati fisiologici di cellule, ma la sua applicazione varia tra le specie. Questo studio fornisce un protocollo per determinare con precisione la mortalità delle cellule all'interno di una popolazione cianobatterio, senza sottovalutare o la registrazione di risultati falsi positivi.

Abstract

Sottopopolazioni microbiche in studi sul campo e di laboratorio hanno dimostrato di visualizzare elevata eterogeneità nei parametri morfologici e fisiologici. Determinare il reale stato tempo da una cella microbica va oltre le categorie, vivi o morti, come possono esistere microbi in uno stato inattivo, per cui la divisione cellulare e attività metaboliche sono ridotti. Data la necessità di individuazione e la quantificazione dei microbi, citometria a flusso (FCM) con sonde molecolari fornisce un metodo rapido e accurato per determinare la redditività complessiva della popolazione. Utilizzando Sytox verde e Sytox arancione nel modello cianobatteri Microcystis aeruginosa per rilevare l'integrità della membrana, sviluppiamo un metodo trasferibile per una rapida indicazione di mortalità singola cellula. Le sonde molecolari utilizzati all'interno di questa rivista si farà riferimento alle sonde di acidi nucleici come verde o arancione rispettivamente (anche se ci sono altri prodotti con simili eccitazione e di emissione che hanno una modalità comparabili di action, abbiamo espressamente riferimento alla ribalta menzionato sonde). Protocolli che utilizzano sonde molecolari variano tra le specie, che differiscono principalmente in tempi di concentrazione e di incubazione. Seguendo questo protocollo intraprendere M.aeruginosa sonda verde acido nucleico è stato ottimizzato a concentrazioni di 0,5 mM dopo 30 min di incubazione e la sonda di acido nucleico a 1 pM arancione dopo 10 min. In entrambe le concentrazioni sonde in meno rispetto alla ottimale indicata portato ad un sotto segnalazione di cellule con danni membrana. Al contrario, 5 mM concentrazioni e superiore in entrambe le sonde hanno mostrato un tipo di colorazione aspecifica, per cui le cellule 'dal vivo' hanno prodotto una fluorescenza bersaglio, portando ad una rappresentazione su di numero di cellule 'non vitali. I controlli positivi (calore ucciso), a condizione biomassa morto verificabile, anche se l'opportunità di generazione di controllo rimane oggetto di dibattito. Dimostrando una sequenza logica di passi per ottimizzare le sonde di acido nucleico verde e arancione noi demonstrate come creare un protocollo che può essere utilizzato per analizzare efficacemente stato fisiologico cianobatteri.

Introduction

La cella è un sistema complesso, che risponde costantemente all'ambiente modificando parametri fisiologici e alterarne la funzione. Dinamica delle popolazioni di popolazioni microbiche isogeni sia in natura e di laboratorio sono danneggiati dallo sviluppo di sottopopolazioni, che si verificano anche in condizioni ambientali relativamente costanti ^{1 – 3.} La variabilità delle comunità microbiche naturali nasce a causa della natura altamente variabile delle condizioni ambientali. Questi processi talvolta stocastici successivamente producono sottopopolazioni che sono molto diversa da quella media della popolazione. Recenti evidenze hanno rivelato che queste sottopopolazioni fisiologiche reazioni diverse condizioni ambientali e possono produrre composti di segnale o inibitori che colpiscono drammaticamente e influenzano il ^3,4 popolazione complessiva.

Stabilire un metodo per definire l'eterogeneità all'interno di una popolazione è la chiave per unprensione l'ecologia dei microbi in vari ambienti ed è essenziale per la costruzione di conoscenza di cianobatteri fastidio, come il Microcystis tossici, che incide pesantemente sulla sicurezza dell'acqua umana. Specie, come Anabaena visualizzare l'eterogeneità morfologica in risposta alle fluttuazioni ambientali, lo sviluppo di cellule specializzate come eterocisti e akinetes ^2. Al contrario, le cellule Microcystis non visualizzano evidente eterogeneità morfologica durante una risposta allo stress. La discriminazione tra cellule vitali e non vitali è l'aspetto più importante di differenziazione fisiologica e consente una migliore comprensione della dinamica delle popolazioni microbiche. Tuttavia, il problema concettuale di vitalità batterica stessa rimane difficile e poco caratterizzati ^1,5,6.

Citometria a flusso (FCM) è un metodo affidabile e veloce di analizzare singole cellule. Per aumentare la comprensione della fisio singola cellulalogia attraverso FCM, sonde molecolari sono stati utilizzati per distinguere una serie di processi metabolici e biochimici ^7. Ciò ha portato ad una maggiore conoscenza delle specie a livello cellulare e la popolazione ea sua volta aiutato gestione delle risorse idriche ^8,9. Tuttavia, gli organismi differiscono in termini di assorbimento di sonda molecolare e efflusso a causa dei pori e pompe in pareti e membrane cellulari, che hanno portato ad una serie di progettazione della sonda molecolare e implementazione del protocollo ^6,10,11. Sonde molecolari disponibili a fini commerciali e di ricerca sono spesso forniti con un protocollo generico che può essere applicabile a un tipo di cellule molto diverso. Si deve fare molta attenzione nel trasferire protocolli sviluppati per un tipo cellulare all'altro ^6, è quindi un compito essenziale per ottimizzare sonde molecolari efficacemente prima dell'uso.

Le sonde di acidi nucleici verde e arancione si legano a due acidi nucleici doppie e singole flessibili con base minimale selezionareivity e sono utilizzati per valutare l'integrità della membrana plasmatica delle cellule. La sonda verde acido nucleico ha un netto miglioramento segnale di fluorescenza marcatura delle cellule rispetto ad altre sonde molecolari, come i composti a base di ioduro di ^propidio-12, che può anche agire come un indicatore della vitalità cellulare. Il termine 'vitalità cellulare' qui si presuppone che la degradazione del DNA si verifica dopo la perdita di integrità della membrana plasmatica. Le sonde di acido nucleico sono coloranti cianinici asimmetrici con tre cariche positive e non possono entrare nelle cellule con membrane intatte sotto concentrazioni caratterizzati, sia eucariotiche e procariotiche ^{14,15 11,13} organismi. Il legame di una sonda di acido nucleico ad acidi nucleici può portare fino a un aumento di emissioni di fluorescenza da segnali endogeni> 500 in cellule che hanno la loro integrità della membrana compromessa. Sebbene sonde molecolari quali sonda verde acido nucleico può essere un buon indicatore della fisiologia singola cella, è necessario to ottimizzare ogni sonda con il previsto obiettivo di organismo, come i tempi di incubazione hanno variato dal 7 min – 30 min e concentrazione varia da 0,1 micron – 0,5 micron di esperimenti Microcystis solo ^15-19.

Qui vi presentiamo un protocollo per ottimizzare le analisi di citometria di verde e relativamente nuove sonde di acidi nucleici arancione (che fino ad oggi non sono stati testati sulla specie di cianobatteri M.aeruginosa). Il seguente metodologia sviluppata può essere trasferita ad altre specie e usato come piattaforma per ottimizzare protocolli in altre sonde molecolari, aumentando così la comprensione di microbi e il loro comportamento ecologico.

Protocol

1. Preparazione della sonda molecolare e citofluorimetro Diluire le soluzioni madre delle sonde di acido nucleico, che vengono forniti come soluzione 5 mM in dimetilsolfossido (DMSO) per aliquote di concentrazioni richieste in ultrapura filtrato H 2 O. Conservare le sonde di acido nucleico in condizioni di oscurità tra -5 ° C e – 25 ° C fino al momento dell'uso. Accendere il citofluorimetro e pacchetto software di carico (vedi tabella dei materiali /…

Representative Results

Forward scatter luce (FSC) e uscite luce laterale scatter (SSC) da una cultura lotto M.aeruginosa in fase esponenziale fornisce informazioni sulla dimensione della cella (diametro) e granularità interno rispettivamente (Figura 1A). FSC può discriminare le cellule che sono troppo grandi e / o piccolo per essere M.aeruginosa. Questa discriminazione o di gating può essere fatto da dati di raffinazione tra alcuni punti di una uscita FSC (Figura 1…

Discussion

Le aumento del numero di pubblicazioni utilizzando sonde molecolari indica che i dati affidabili e informativi possono essere ottenuti ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Come ancora non c'è nessuna macchia perfetta per la vitalità cellulare che può essere efficace in tutte le specie con la stessa concentrazione e l'incubazione tempo ^6,10. Anche lo stesso tipo di sonda con emissioni di fluorescenza alterati mostra la necessità di stabilire la concentrazione e l'incubazione or…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO