Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio
Summary
We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.
Abstract
The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.
Introduction
Ao contrário das culturas 2D padrão, modelos de cultura de células de substituição 3D permitem o estudo do comportamento das células epiteliais num contexto fisiologicamente relevante, um tecido semelhante a um. culturas 3D da glândula mamária ajudaram a explicar muitos aspectos do desenvolvimento da glândula mamaria e neoplasia. No entanto, a maioria dos modelos de cultura 3D actualmente disponíveis não são adequados para estudar a acção hormonal, porque as linhas de células epiteliais humanos utilizados para a tarefa não possuem a expressão do receptor da hormona 6,7,9.
Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio mamário humano que é adequado para estudar a ação hormonal 12. Este modelo utiliza a linha disponível comercialmente hormona de resposta epitelial humano da mama celular, T47D 3,11,13, que foram originalmente derivados de um derrame pleural obtido a partir de um paciente do sexo feminino de 54 anos com um carcinoma ductal infiltrante da mama. Nós usamos ratos colagénio de cauda de tipo 1 como uma matriz. Este culto 3Dure modelo é apropriado para o estudo da acção dos três principais hormonas mammotropic (estradiol, promegestona (um análogo da progesterona), e prolactina) em células epiteliais da mama humanas. Morfologia epitelial induzida por hormona pode ser avaliado quantitativamente ao longo do tempo através de análises morfométricas 12.
Uma densidade de semeadura adequada permite que essas culturas em 3D para ser mantido por 2 semanas. Por esta altura, o desenvolvimento de estruturas é suficiente para uma avaliação quantitativa da acção da hormona robusta na morfologia epitelial. Os géis podem também ser colhidas a pontos de tempo anteriores para a proliferação celular e analisa a expressão do gene. Além disso, este modelo é apropriado para testar os efeitos de um tratamento hormonal sequencial; por exemplo, após o tratamento com estradiol durante a primeira semana e substituição com outra hormona / combinação de hormonas durante a semana seguinte. O efeito dos compostos estrogénicos e anti-estrogénios, tais como a ICI 182,780, também pode ser stumorreu usando este modelo de cultura 3D 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a hormone-sensitive 3D culture model to test the action of hormones on breast epithelium. The response to hormones can be assessed at the tissue morphology, cell proliferation and gene expression levels 12. One limitation of this technique is that visualization during the culture period is restricted to light microscopy since the cultures are grown in a plastic bottom plate. The 3D culture system could be adapted to glass bottom plates to allow for live imaging of the cultures 1.</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos imensamente as contribuições editoriais pela Cheryl Schaeberle. Esta pesquisa foi apoiada pela Avon Grants # 02-2009-093 e 02-2011-095, e NIEHS / NIH ES 08.314 para AMS. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental ou o National Institutes of Health.
Materials
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20mL | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Referências
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