Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel
Summary
We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.
Abstract
The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.
Introduction
In tegenstelling tot standaard 2D culturen 3D celkweek surrogaat apparaten kan de studie van epitheelcel gedrag in een fysiologisch relevante context, iemand als een weefsel. 3D culturen van de borstklier geholpen verhelderen vele aspecten van ontwikkeling van de borstklier en neoplasie. De meeste van de 3D cultuurmodellen momenteel beschikbaar zijn ongeschikt hormoonactie bestuderen omdat het menselijke epitheliale cellijnen gebruikt voor de taak missen hormoonreceptor expressie 6,7,9.
Hierin beschrijven we een 3D cultuurmodel van de menselijke borst epitheel die geschikt is om hormooninwerking 12 bestuderen. Dit model maakt gebruik van de commercieel verkrijgbare hormoon reagerende menselijke borst epitheel cellijn, T47D 3,11,13, die oorspronkelijk waren afgeleid van een pleurale effusie verkregen uit een 54 jaar oude vrouwelijke patiënt met een infiltrerend ductaal carcinoom van de borst. We maken gebruik van rattenstaart collageen type 1 als een matrix. Deze 3D culture model is geschikt voor de studie van de werking van de drie mammotropic hormonen (estradiol, promegeston (een analoog van progesteron) en prolactine) menselijke borst epitheelcellen. Hormoon-geïnduceerde epitheliale morfologie kan kwantitatief worden geëvalueerd na verloop van tijd door morfometrische analyse 12.
Een geschikte zaaidichtheid kunnen deze 3D kweken gedurende 2 weken worden bewaard. Tegen die tijd, de ontwikkeling van structuren is voldoende voor een robuuste kwantitatieve beoordeling van hormoonwerking op epitheliale morfologie. Gels kunnen ook worden geoogst eerdere tijdstippen voor celproliferatie en genexpressie analyses. Daarnaast heeft dit model geschikt om de effecten van een sequentiële hormonale behandeling getest; bijvoorbeeld na behandeling met estradiol gedurende de eerste week en vervanging door andere hormonen / combinatie van hormonen in de volgende week. Het effect van oestrogene stoffen en anti-oestrogenen, zoals ICI 182.780, kan worden stustierf het gebruik van deze 3D-cultuur model 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a hormone-sensitive 3D culture model to test the action of hormones on breast epithelium. The response to hormones can be assessed at the tissue morphology, cell proliferation and gene expression levels 12. One limitation of this technique is that visualization during the culture period is restricted to light microscopy since the cultures are grown in a plastic bottom plate. The 3D culture system could be adapted to glass bottom plates to allow for live imaging of the cultures 1.</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We waarderen de redactionele bijdragen van Cheryl Schaeberle. Dit onderzoek werd gesteund door Avon Grants # 02-2009-093 en 02-2011-095 en NIEHS / NIH ES 08.314 naar AMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Environmental Health Sciences of de National Institutes of Health.
Materials
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20mL | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Referências
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells’ phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
