Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio
Summary
We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.
Abstract
The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.
Introduction
A diferencia de los cultivos 2D estándar, modelos sustitutos de cultivo de células 3D permiten el estudio del comportamiento de las células epiteliales en un contexto fisiológicamente relevante, uno parecido a un tejido. culturas 3D de la glándula mamaria han ayudado a aclarar muchos aspectos del desarrollo de la glándula mamaria y la neoplasia. Sin embargo, la mayoría de los modelos de cultivo 3D disponibles actualmente no son adecuados para estudiar la acción hormonal porque las líneas de células epiteliales humanos utilizados para la tarea carecen de expresión del receptor de la hormona 6,7,9.
En este documento, se describe un modelo de cultivo 3D del epitelio de mama humano que es adecuado para estudiar la acción hormonal 12. Este modelo usa la línea disponible en el mercado sensible a hormonas humana epiteliales de mama celular, T47D 3,11,13, que se deriva originalmente de un derrame pleural obtenida de un paciente femenino de 54 años con un carcinoma ductal infiltrante de la mama. Utilizamos rata colágeno de cola de tipo 1 como una matriz. Este culto 3Dmodelo ure es apropiado para el estudio de la acción de las tres hormonas mammotropic principales (estradiol, promegestona (un análogo de progesterona), y prolactina) en células epiteliales de mama humanos. La morfología del epitelio inducida por la hormona se puede evaluar cuantitativamente a través del tiempo mediante análisis morfométricos 12.
Una densidad de siembra apropiada permite a estos cultivos en 3D que se le mantenga durante 2 semanas. Por este tiempo, el desarrollo de estructuras es suficiente para una evaluación cuantitativa robusta de la acción hormonal en la morfología epitelial. Los geles también se pueden cosechar en puntos de tiempo anteriores para la proliferación celular y los análisis de la expresión génica. Además, este modelo es adecuado para probar los efectos de un tratamiento hormonal secuencial; por ejemplo, después del tratamiento con estradiol durante la primera semana y el reemplazo con otra hormona / combinación de hormonas durante la siguiente semana. El efecto de los compuestos y antiestrógenos estrogénicos, tales como ICI 182780, también se puede Stumurió el uso de este modelo de cultivo 3D 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a hormone-sensitive 3D culture model to test the action of hormones on breast epithelium. The response to hormones can be assessed at the tissue morphology, cell proliferation and gene expression levels 12. One limitation of this technique is that visualization during the culture period is restricted to light microscopy since the cultures are grown in a plastic bottom plate. The 3D culture system could be adapted to glass bottom plates to allow for live imaging of the cultures 1.</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos enormemente las contribuciones de redacción por Cheryl Schaeberle. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de Avon # 02-2009-093 y 02-2011-095, y NIEHS / NIH ES 08314 a AMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental o de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20mL | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Referências
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