Fotoaktiveret Lokalisering Mikroskopi med bimolekylær Fluorescens Komplementering (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
Protein-protein interaktioner (PPI) er grundlæggende for biologi 1 og er stramt reguleret via spatiotemporale mekanismer på tværs af mange tid og længde skalaer. Undersøgelser af celle signalering på cellemembranen, for eksempel, har afsløret dynamiske nanostørrelse rumlige rum, der letter specifikke PPI og cellulære processer 2. Derfor er evnen til at sondere PPI i biologiske systemer med tilstrækkelige rumlige og tidslige resolutioner, høj specificitet og høj følsomhed er nøglen til at opnå en mekanistisk forståelse af biologi.
Bimolekylære fluorescens komplementering (BiFC) er en af de få eksisterende værktøjer til at visualisere PPI i en celle med subcellulær opløsning og leve-celle kompatibilitet 3-5. Teknikken er relativt ligetil og involverer opsplitning af en fluorescens protein i to ikke-fluorescerende fragmenter; når genetisk kodet til to interagerende proteiner ogbringes i nærhed, kan fragmenterne rekonstituere at danne en komplet fluorescerende protein, hvilket gav fluorescerende signal. Når korrekt udformet, bør BiFC sonder ikke spontant rekonstituering i mangel af PPI. Som sådan vil fluorescens signal i et BiFC assay kun opstå i overværelse af PPI, som muliggør direkte visualisering af PPI med høj specificitet. Yderligere fordele ved anvendelse af fluorescens som udlæsningen er høj følsomhed, subcellulær opløsning og kompatibilitet med højt gennemløb og højt indhold screeningsassays, blandt andre. For disse fordele, er der blevet udviklet en række BiFC prober baseret på forskellige forældre fluorescerende proteiner. Som i alle andre detektionsteknikker baseret på konventionelle lysmikroskopi imidlertid den rumlige opløsning af BiFC begrænset til ~ 250 nm ved diffraktion af lys. Dette gør det til en udfordring at studere reguleringen af PPI på nanoskala, der, som hentydede tidligere og eksemplificeret ved lipidklumper 6 and Ras nanoclusters 7, er en kritisk længde skala til at forstå mange cellulære processer, såsom signalering.
BiFC er blevet kombineret med fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) 8,9 for at overvinde denne grænse i rumlig opløsning til billeddannelse PPI'er 10. PALM er en nyere superresolution mikroskopi teknik, der omgår diffraktionsgrænsen i fluorescens billeddannelse gennem stokastisk aktivering og subdiffractive lokalisering af enkelte fluorescerende molekyler. I hver aktivering cyklus, et fluorescerende molekyle udsender et par hundrede til nogle få tusinde fotoner og giver anledning til et enkelt molekyle billede på detektoren. Mens billedet er diffraktionsbegrænset (~ 250 nm i bredden), dens tyngdepunkt kan bestemmes med meget større præcision, typisk i størrelsesordenen 10-50 nm afhængigt af antallet af fotoner detekteret. Ved at aktivere og lokalisere hvert fluorescerende molekyle i prøven, kan en høj opløsning billede rekonstrueres. Performed på levende celler, enkelt molekyle tracking (smt-) PALM yderligere tilladelser erhvervelse af tusindvis af protein diffusion baner fra en enkelt celle 11. Det er vigtigt, anvender PALM specialiserede fluorescerende prober såsom fotoaktiverbare fluorescerende proteiner (PA-RP) for at opnå stokastisk aktivering. Da både BiFC og PALM brug fluorescerende proteiner, blev de samlet ved at opdele PAmCherry1, et almindeligt anvendt PA-FP for PALM, i to fragmenter mellem aminosyrer 159 og 160.
Det BiFC system baseret på split PAmCherry1 viser lav baggrund signal fra spontan rekonstituering af de to fragmenter. Når genetisk mærkede til et par interagerende proteiner, de to fragmenter (RN = resterne 1-159, RC = Met + rester 160-236) rekonstitueret effektivt til at danne komplette PAmCherry1 proteiner selv ved 37 ° C og uden inkubering ved lavere temperaturer, hvilket er ikke tilfældet for andre BiFC par 12 som den forælder mCherry 13. Furthermore, den rekonstituerede PAmCherry1 protein beholdt fotofysiske egenskaber moderselskabets PAmCherry1, såsom højt kontrastforhold, medium foton udbytte, og hurtigt fotoaktivering, blandt andre, som er afgørende for præcis enkelt molekyle lokalisering og høj opløsning PALM billeddannelse.
I denne protokol, brug af BiFC-PALM til billeddannelse Ras-Raf interaktioner i U2OS celler ved hjælp af split PAmCherry1 (figur 1A) er beskrevet. Det første trin er at designe konstruktionerne til ekspression af fusionsproteiner mellem PAmCherry1 fragmenter (dvs. RN og RC) og proteinerne af interesse. I teorien, for hvert par af kandidat-proteiner (A og B), er der otte par fusionsproteiner der skal testes: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; og A-RC / B-RN. Denne proces kan ofte forenkles ved at tage hensyn til de strukturelle eller biokemiske egenskaber af kandidat-proteiner. I tilfælde af Ras proteinet erposttranslationelt modificeret ved C-terminale CAAX (C = Cys; A = alifatisk; X = en hvilken som helst), hvorefter AAX motivet fraspaltes. Derfor kan RN eller RC kun fusioneret til N-terminalen af Ras; Dette reducerer antallet af fusionsprotein par til fire (figur 1B). For Raf, Ras-bindingsdomænet (RBD -rester 51-131) anvendes, og kan mærkes i begge ender. Disse fire fusion konfigurationer blev genereret: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; og RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Derudover vil linkeren mellem fragmenterne og proteinerne af interesse skal overvejes. En fleksibel linker på ca. ti aminosyrer anvendes ofte, da det giver tilstrækkelig frihed til komplementation at forekomme. En sådan linker er (GGGGS) x2, selv om der er mange andre, der er blevet anvendt med succes, herunder vilkårlige sekvenser genereret fra et multipelt kloningssted (MCS) 14. Længden af linkerne kan være nødvendigt at optimere depending af størrelsen af proteinerne af interesse og deres orienteringer, når de vekselvirker.
De PAmCherry1 fragmenter er indeholdt i en lille kloning backbone med flankerende MCSS (se Materialer List). Gener af interesse kan indsættes via restriktionssteder eller med en ligation-uafhængig metode. Efter kloning og sekvensanalyse kontrol, er ekspressionskassetten overført til en ekspressionsvektor under anvendelse af en rekombinase reaktionen blev en kloning processen med high fidelity og høj effektivitet.
Dernæst følger ekspressionskonstruktioner transficeret i målcellen linje eller, hvis der ønskes en stabil cellelinie, pakkes i lentivirus til at inficere målcellen linje. Transient transfektion giver mulighed for hurtig validering af BiFC konfigurationer, men potentielle problemer, skal noteres. Transfektion ved hjælp kemikalier ofte understreger cellerne, hvilket resulterer i høj autofluorescens; mens anvendelsen af total indre refleksion fluorescens (TIRF) microscopy kan afbøde denne baggrund signal ved at begrænse belysningen volumen, TIRF ideel, når de PPI finde sted på cellemembranen. Derudover transiente transfektioner ofte føre til høje niveauer af proteinekspression, der langt overstiger de af endogene proteiner, som kan forårsage artefakter i detektering af PPI. Det derfor anbefales, at stabile cellelinier etableres efter en passende BiFC konfiguration er bestemt ved første afprøvning. Stabile cellelinier har også potentiale for afstemmelige udtryk via doxycyclin induktion 15.
Efter infektion blev celler vælges med antibiotika, typisk puromycin og neomycin, en for hver konstruktion. De efterfølgende trin for prøveforberedelse, billedoptagelse, og dataanalyse vil blive beskrevet i detaljer i protokollerne.
Med denne fremgangsmåde, er dannelsen af nanoskala klynger i BiFC-PALM billeder af Ras-Raf RBD rutinemæssigt observeret (figur 2A </ strong>). Konsekvent, smt-PALM baner af Ras-Raf RBD viser en heterogen fordeling i diffusion stater (figur 2B-D). Disse resultater tyder på, at der findes Ras-Raf komplekser i flere stater på cellemembranen, formentlig som monomerer og klynger, med potentielle biologiske implikationer. Dette arbejde demonstrerer magt BiFC-PALM i selektiv billeddannelse af PPI i celler med nanometer rumlig opløsning og enkelt molekyle følsomhed, hvilket ville være vanskeligt at opnå med konventionel BiFC, fluorescens co-lokalisering, eller fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).
Ved udformningen BiFC eksperimenter og fortolkning af resultater, er det vigtigt at huske på, at BiFC er irreversibel i de fleste tilfælde, herunder split PAmCherry1. Når de to fragmenter danner et komplet PAmCherry1 protein, forbindelsen mellem de to fragmenter og kombinere og dermed PPI bliver permanent. Dette begrænser brugen af BiFC og BiFC-PALM til overvågning af dynamikken i PPI (dvs. bindingskinetik og ikke de diffusions- dynamik proteinkomplekset snart den er dannet), og til tider kunne endda føre til mislocalization af PPI komplekser.
En yderligere faktor til at overveje, når designe BiFC-PALM eksperimenter er forsinkelsen i kromofor modning, der ligger i fluorescerende proteiner. Når to proteiner interagerer og FP fragmenter kommer sammen, de typisk genfolde af størrelsesordenen sekunder (halv tid på 60 sek til EYFP 3). Dog medfører efterfølgende kromofor modning og fluorescerende signal udvikle sig på størrelsesordenen minutter. Mens fluorescens kan være påviselig inden for 10 min efter opløsning af split-Venus, en hurtigt folde YFP variant den halve tid til modning i almindelighed er ofte omkring 60 min 16. Split-PAmCherry1 blev observeret at have lignende priser. Derfor BiFC og BiFC-PALM i øjeblikket dårlige valg til overvågning i realtid PPI kinetik; andre migthods, såsom FRET og en nylig udviklet dimerisering afhængige fluorescerende protein 17, kan være mere egnet til dette formål.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC har været et almindeligt anvendt teknik til påvisning og visualisere PPI i celler, mens PALM er en nyere enkelt molekyle superresolution mikroskopi teknik, der gør det muligt nanoskala billeddannelse af intakte biologiske prøver. Kombinationen af BiFC med PALM opnået selektiv billeddannelse af PPI inde i en celle med nanometer rumlig opløsning og enkelt molekyle følsomhed. BiFC-PALM udvider nytten af begge teknikker, og som påvist i dette arbejde, viser meget lovende i at afsløre de molekylære…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Referências
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
