Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología ¹ y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares ^2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología.

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) es una de las pocas herramientas existentes para la visualización de los IBP en una celda con resolución subcelular y la compatibilidad de las células vivir ^3-5. La técnica es relativamente sencilla y consiste en la división de una proteína de fluorescencia en dos fragmentos no fluorescentes; cuando etiquetados genéticamente para dos proteínas que interactúan ypuesto en proximidad, los fragmentos pueden reconstituir para formar una proteína fluorescente completa, dando señal fluorescente. Cuando se diseñan adecuadamente, sondas BiFC no deben reconstituir de forma espontánea en ausencia de IBP. Como tal, la señal de fluorescencia en un ensayo de BiFC sólo surgir en la presencia de los IBP, que permite la visualización directa de los IBP con alta especificidad. Beneficios adicionales de utilizar la fluorescencia como la lectura son de alta sensibilidad, resolución subcelular, y la compatibilidad con un alto rendimiento y ensayos de cribado de alto contenido, entre otros. Para estos beneficios, una serie de sondas BiFC basados ​​en diferentes proteínas fluorescentes padres se han desarrollado. Como en todas las otras técnicas de detección basados ​​en microscopía de luz convencional, sin embargo, la resolución espacial de BiFC se limita a ~ 250 nm por la difracción de la luz. Esto hace que sea un reto para estudiar la regulación de los IBP en la nanoescala, que, como se aludió antes y ejemplificado por las balsas de lípidos ^6and nanoclusters Ras ^7, es una escala de longitud crítica para la comprensión de muchos procesos celulares como la señalización.

BiFC se ha combinado con microscopía de localización fotoactivado ^(PALM) 8,9 para superar este límite de la resolución espacial para obtener imágenes de los IBP ^10. PALM es una técnica de microscopía de super-resolución reciente que elude el límite de difracción en imágenes de fluorescencia a través de la activación estocástico y localización subdiffractive de moléculas fluorescentes individuales. En cada ciclo de activación, una molécula fluorescente emite unos pocos cientos a unos pocos miles de fotones y da lugar a una sola imagen molécula en el detector. Mientras que la imagen es de difracción limitada (~ 250 nm de anchura), su centroide se puede determinar con precisión mucho mayor, típicamente del orden de un 10-50 nm en función del número de fotones detectados. Mediante la activación y localización de cada molécula fluorescente en la muestra, una imagen de alta resolución puede ser reconstruido. Performed en las células vivas, sola molécula de seguimiento (SMT-) PALM permite además adquisición de miles de trayectorias de difusión proteína a partir de una sola célula ^11. Es importante destacar que, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados tales como proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-PM) para lograr la activación estocástico. Dado que tanto BiFC y proteínas fluorescentes uso PALM, que se combinaron mediante el fraccionamiento de PAmCherry1, un PA-FP comúnmente utilizado para PALM, en dos fragmentos entre los aminoácidos 159 y 160.

El sistema basado en PAmCherry1 BiFC dividida muestra una baja señal de fondo de la reconstitución espontánea de los dos fragmentos. Cuando etiquetado genéticamente a un par de proteínas que interactúan, los dos fragmentos (RN = residuos 1 a 159; RC = Met + residuos 160-236) reconstituido de manera eficiente para formar proteínas completas PAmCherry1 incluso a 37 ° C y sin incubación a temperaturas más bajas, lo cual No es el caso de otros pares BiFC ¹² como el padre mCherry ^13. Furthermore, la proteína PAmCherry1 reconstituido conserva las propiedades fotofísicas del PAmCherry1 padres, tales como alta relación de contraste, rendimiento de fotones medio y fotoactivación rápida, entre otros, que son fundamentales para la exacta localización sola molécula y de imágenes PALM alta resolución.

En este protocolo, se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS utilizando dividida PAmCherry1 (Figura 1). El primer paso es el diseño de las construcciones para la expresión de proteínas de fusión entre los fragmentos PAmCherry1 (es decir, RN y RC) y las proteínas de interés. En teoría, para cada par de proteínas candidatas (A y B), hay ocho pares de proteínas de fusión a ensayar: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; y A-RC / B-RN. Este proceso a menudo se puede simplificar teniendo en cuenta las propiedades estructurales o bioquímicas de las proteínas candidatas. En el caso de Ras, la proteína esdespués de la traducción modificado el cuadro de CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = cualquier), después de lo cual el motivo AAX se escinde. Por lo tanto, RN o RC sólo pueden ser fusionados con el extremo N-terminal de Ras; esto reduce el número de pares de proteína de fusión a cuatro (Figura 1B). Para Raf, los dominios Ras vinculante (RBD; residuos 51-131) se utiliza y se pueden etiquetar en cada extremo. Se generaron Estas cuatro configuraciones de fusión: RN-KRas / RC-Raf RBD; RN-KRas / Raf RBD-RC; RC-KRas / RN-Raf RBD; y RC-KRas / Raf RBD-RN.

Además, tendrá que ser considerado el enlazador entre los fragmentos y las proteínas de interés. Un enlazador flexible de aproximadamente diez aminoácidos se utiliza a menudo, ya que proporciona la suficiente libertad para la complementación que se produzca. Uno de estos es enlazador (GGGGS) x2, aunque hay muchos otros que se han aplicado con éxito, incluyendo secuencias aleatorias generadas a partir de un sitio de clonación múltiple (MCS) ^14. La longitud de los enlazadores puede necesitar ser optimizado depending del tamaño de las proteínas de interés y sus orientaciones cuando interactúan.

Los fragmentos PAmCherry1 están contenidos en una pequeña columna vertebral de la clonación con flanqueando MCSs (ver Lista de Materiales). Los genes de interés se pueden insertar a través de los sitios de restricción o con un método de ligadura independiente. Después de la clonación y la secuencia de verificación, el casete de expresión se transfiere a un vector de expresión usando una reacción de recombinasa, un proceso de clonación con alta fidelidad y alta eficiencia.

A continuación, las construcciones de expresión resultantes se transfectaron en la línea de célula diana o, si se desea una línea celular estable, empaquetado en lentivirus para infectar la línea celular objetivo. La transfección transitoria permite la validación rápida de las configuraciones BiFC, pero los problemas potenciales debe tenerse en cuenta. La transfección utilizando productos químicos a menudo hace hincapié en las células, lo que resulta en alta autofluorescencia; mientras que el uso del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopy puede mitigar esta señal de fondo mediante la limitación del volumen de la iluminación, TIRF ideal cuando los IBP tienen lugar en la membrana celular. Además, las transfecciones transitorias a menudo conducen a altos niveles de expresión de proteínas, muy por encima de los de las proteínas endógenas, que pueden causar artefactos en la detección de los IBP. Por lo tanto, se recomienda que se establezcan líneas celulares estables después de una configuración apropiada BiFC se ha determinado a través de pruebas inicial. Las líneas celulares estables también tienen el potencial para la expresión sintonizable mediante doxiciclina inducción ^15.

Después de la infección, las células se seleccionan con antibióticos, por lo general puromycin y neomicina, uno para cada constructo. Los pasos subsiguientes para la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y análisis de datos se describen en detalle en los protocolos.

Con este enfoque, la formación de agrupaciones de nanoescala en imágenes BiFC-palma de Ras-Raf RBD se observan rutinariamente (Figura 2A </ strong>). Consistentemente, trayectorias smt-palma de Ras-Raf RBD muestran una distribución heterogénea en los estados de difusión (Figura 2B-D). Estos resultados sugieren que existen complejos de Ras-Raf en varios estados en la membrana celular, presumiblemente como monómeros y clusters, con potenciales implicaciones biológicas. Este trabajo demuestra el poder de BiFC-PALM en imagen selectiva de los IBP en células con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula, que sería difícil de obtener con BiFC convencional, fluorescencia co-localización, o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).

En el diseño de experimentos BiFC e interpretación de los resultados, es importante tener en cuenta que el proceso BiFC es irreversible en la mayoría de casos, incluyendo PAmCherry1 dividida. Una vez que los dos fragmentos se combinan y forman una proteína PAmCherry1 completa, el enlace entre los dos fragmentos, y por lo tanto el PPI se convierte en permanente. Esto limita el uso de BiFC y BiFC-PALM para el seguimiento de la dinámica de los IBP (es decir, la cinética de unión y no la dinámica de difusión del complejo de proteínas, una vez que se forma) y, a veces incluso podría conducir a mislocalization de los complejos de PPI.

Un factor adicional a tener en cuenta en el diseño de experimentos BiFC-PALM es el retraso en la maduración cromóforo que es inherente a las proteínas fluorescentes. Una vez que dos proteínas interactúan y los fragmentos de PF se unen, por lo general refold del orden de segundos (tiempo-medio de 60 seg para EYFP ^3). Sin embargo, la maduración cromóforo subsiguiente y la señal fluorescente se desarrollan en el orden de minutos. Mientras que la fluorescencia puede ser detectable en 10 minutos después de la reconstitución de la fracción de Venus, una variante de rápido plegado YFP, el tiempo medio para la maduración en general es a menudo alrededor de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 se observó a tener tasas similares. Por lo tanto, BiFC y BiFC-PALM son opciones actualmente pobres para el seguimiento de la cinética de PPI en tiempo real; otro yothods, tales como FRET y una proteína fluorescente dependiente de la dimerización recientemente desarrollado ^17, pueden ser más adecuados para este propósito.

Protocol

1. Clonación Determine las configuraciones de clonar y elegir un enlazador. Proteínas de la etiqueta con los fragmentos de la N- o C-terminal como se describe a continuación para que no interrumpan su correcta localización. Utilice un enlazador flexible, tal como (GGGGS) x2. Genéticamente etiquetar las proteínas de interés a los fragmentos PAmCherry1. Como una opción, utilice los plásmidos de clonación que figuran en la Lista de materiales que contienen los fragmentos de RN (residuos PAmCh…

Representative Results

El ejemplo BiFC-PALM mostrado es KRas G12D mutante interactuar con los Ras vinculante dominio (RBD) de FARC (Figura 1). Como se ha discutido, la RN o fragmentos de RC no se marcaron a la C-terminal de Ras, ya que perturbaría la localización de la membrana y por lo tanto la actividad biológica de Ras. Esto reduce las posibles combinaciones de ocho a cuatro (Figura 1B). Cada una de estas cuatro combinaciones se introdujo en células U2OS utilizando la infección lentiviral. Las célula…

Discussion

BiFC ha sido una técnica comúnmente utilizada para la detección y la visualización de los IBP en las células, mientras que PALM es una técnica de microscopía reciente sola molécula de super-resolución que permite formación de imágenes a nanoescala de muestras biológicas intactas. La combinación de BiFC con PALM logra imagen selectiva de los IBP en el interior de una celda con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula. BiFC-PALM extiende la utilidad de ambas técnicas, y como se demues…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks