Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a biologia ¹ e sejam estritamente regulado através de mecanismos de espaço-temporais em muitas escalas de tempo e comprimento. Estudos sobre a sinalização celular na membrana celular, por exemplo, revelaram, compartimentos espaciais em nanoescala dinâmicos que facilitam PPIs específicas e processos celulares ^2. Assim, a capacidade de sondar os IPP em sistemas biológicos com resoluções suficientes espaciais e temporais, alta especificidade e alta sensibilidade é fundamental para alcançar um entendimento mecanicista da biologia.

Bimolecular fluorescência complementação (BiFC) é uma das poucas ferramentas existentes para visualizar PPIs em uma cela com resolução subcelular e compatibilidade de células viver ^3-5. A técnica é relativamente simples e envolve a divisão de uma proteína de fluorescência em dois fragmentos não fluorescentes; quando geneticamente marcado para duas proteínas interagem etrazida para a proximidade, os fragmentos podem reconstituir, para formar uma proteína fluorescente completa, obtendo-se o sinal fluorescente. Quando projetado corretamente, as sondas BiFC não deve reconstituir espontaneamente na ausência de PPIs. Como tal, o sinal de fluorescência num ensaio de BiFC só surgem, na presença de IPP, o que permite a visualização directa dos IPP com alta especificidade. Os benefícios adicionais da utilização de fluorescência como a leitura são de alta sensibilidade, resolução subcelular, e compatibilidade com alto rendimento e alta ensaios de rastreio de conteúdo, entre outros. Para estes benefícios, foram desenvolvidos um número de sondas diferentes com base em BiFC proteínas fluorescentes pai. Tal como em todas as outras técnicas de detecção baseadas em microscopia óptica convencional, no entanto, a resolução espacial de BiFC é limitada a ~ 250 nm pela difracção da luz. Isto o torna um desafio para estudar a regulação dos IPP em nanoescala, que, como referi anteriormente e exemplificados por jangadas lipídicas ⁶ and Ras nanoclusters ^7, é uma escala de comprimento crítico para a compreensão de muitos processos celulares, tais como sinalização.

BiFC foi combinada com microscopia localização fotoactivado ^(PALM) 8,9 para superar este limite em resolução espacial para a imagem latente PPIs ^10. PALM é uma recente técnica de microscopia SuperResolution que contorna o limite de difração em imagens de fluorescência através da ativação estocástica e localização subdiffractive de moléculas fluorescentes individuais. Em cada ciclo de activação, uma molécula fluorescente emite de algumas centenas a alguns milhares de fotões e dá origem a uma única molécula de imagem no detector. Quando a imagem é limitado por difracção (~ 250 nm de largura), a sua centróide pode ser determinada com muito maior precisão, tipicamente na ordem de 10-50 nm, dependendo do número de fotões detectados. Através da activação e localização de cada molécula fluorescente na amostra, imagem de alta resolução pode ser reconstruído. Performed em células vivas, monitoramento molécula única (smt-) PALM novas autorizações de aquisição de milhares de trajetórias de difusão proteína a partir de uma única célula ^11. Importante, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados, tais como proteínas fluorescentes fotoactiv�eis (PA-FPS) para conseguir a ativação estocástica. Uma vez que tanto BiFC e proteínas fluorescentes uso PALM, eles foram combinados, dividindo PAmCherry1, um comumente usado PA-FP para PALM, em dois fragmentos entre os aminoácidos 159 e 160.

O sistema baseado em PAmCherry1 BiFC dividido mostra baixo sinal de fundo a partir de reconstituição espontânea dos dois fragmentos. Quando geneticamente marcado para um par de proteínas que interagem, os dois fragmentos (RN = resíduos 1-159; RC = MET + resíduos 160-236) reconstituído para formar de forma eficiente proteínas PAmCherry1 completa mesmo a 37 ° C e sem incubação a temperaturas mais baixas, o que Não é o caso de outros pares BiFC ^12, tais como o pai mCherry ^13. Furthermore, a proteína PAmCherry1 reconstituído manteve as propriedades fotofísicas da PAmCherry1 pai, como a alta taxa de contraste, o rendimento médio de fótons, e fotoativação rápido, entre outros, que são críticos para precisas de localização única molécula e de alta resolução de imagem PALM.

Neste protocolo, o uso de BiFC-PALM para imagiologia interações Ras-Raf em células U2OS usando divisão PAmCherry1 (Figura 1A) é descrito. O primeiro passo consiste em conceber as construções para expressar proteínas de fusão entre fragmentos PAmCherry1 (isto é, RN e RC) e as proteínas de interesse. Em teoria, para cada par de proteínas candidatas (A e B), existem oito pares de proteínas de fusão a ser testada: RN-A / RC-B; RN-A / B-Rc; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Este processo muitas vezes pode ser simplificada, tendo em conta as propriedades estruturais ou bioquímicas das proteínas candidatas. No caso de Ras, a proteína émodificada após tradução na caixa CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = qualquer), após o que o motivo AAX é clivada. Assim, RN ou RC só pode ser fundido ao N-terminal de Ras; Isto reduz o número de pares de proteínas de fusão para quatro (Figura 1B). Para Raf, domínio de ligação a Ras (RBD; resíduos 51-131) é usado e pode ser marcado em cada extremidade. Esses quatro configurações de fusão foram gerados: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; e RC-Kras / Raf RBD-RN.

Além disso, o ligante entre os fragmentos e as proteínas de interesse terão de ser consideradas. Um ligante flexível de cerca de dez aminoácidos é frequentemente utilizado como proporciona liberdade suficiente para complementação de ocorrer. Um tal ligante é (GGGGS) x2, embora existam muitos outros que foram aplicadas com êxito, incluindo seqüências aleatórias geradas a partir de um local de clonagem múltipla (MCS) ^14. O comprimento dos elementos de ligação podem precisar de ser optimizada depending do tamanho das proteínas de interesse e que interagem quando as suas orientações.

Os fragmentos PAmCherry1 estão contidos em um pequeno backbone clonagem com flanqueando MCSs (ver Lista de Materiais). Os genes de interesse pode ser inserido através dos locais de restrição ou com um método independente da ligadura. Após a clonagem e sequência de verificação, a cassete de expressão é transferido para um vector de expressão, utilizando uma reacção de recombinase, um processo de clonagem com alta fidelidade e alta eficiência.

Em seguida, as construções de expressão resultantes são transfectados para a linha de células alvo ou, se uma linha celular estável é desejada, empacotado em lentivírus para infectar a linha de células alvo. Transfecção transiente permite a validação rápida das configurações BiFC, mas os potenciais problemas devem ser observados. Transfecção utilizando produtos químicos frequentemente sublinha as células, resultando em alta autofluorescência; enquanto que a utilização de um total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) microscoaa pode mitigar este sinal de fundo, limitando o volume iluminação, TIRF ideal quando os PPIs ocorrem na membrana da célula. Além disso, transfecções transientes muitas vezes levar a elevados níveis de expressão da proteína, muito superiores às das proteínas endógenas, o que pode causar artefactos na detecção do IPP. Assim, recomenda-se que as linhas celulares estáveis ​​após ser estabelecida uma configuração apropriada BiFC foi determinada através de ensaios iniciais. Linhas de células estáveis ​​também têm o potencial para a expressão sintonizável através da indução de doxiciclina ^15.

Após a infecção, as células são seleccionadas com antibióticos, tipicamente puromicina e neomicina, um para cada constructo. Os passos subsequentes de preparação das amostras, a aquisição de imagem e análise de dados será descrito em detalhe nos protocolos.

Com esta abordagem, a formação de clusters em nanoescala em imagens BiFC-palma da Ras-Raf RBD são rotineiramente observados (Figura 2A </ strong>). Consistentemente, trajetórias smt-palma da Ras-Raf RBD apresentam uma distribuição heterogênea nos estados de difusão (Figura 2B-D). Estes resultados sugerem que os complexos de Ras-Raf existir em vários estados na membrana celular, presumivelmente como monómeros e aglomerados, com potenciais implicações biológicas. Este trabalho demonstra o poder da BiFC-PALM em imagem seletiva de PPIs em células com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula, o que seria difícil de obter com BiFC convencional, fluorescência co-localização, ou a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Ao projetar experimentos BiFC e interpretação dos resultados, é importante ter em mente que o processo é irreversível BiFC na maioria dos casos, incluindo PAmCherry1 divisão. Uma vez que os dois fragmentos se combinar e formar uma proteína PAmCherry1 completo, a ligação entre os dois fragmentos, e, assim, torna-se permanente do PPI. Isto limita a utilização de BiFC e BiFC-PALM para monitorar a dinâmica dos PPIs (ou seja, cinética de ligação e não a dinâmica de difusão do complexo de proteína, uma vez que é formado) e às vezes pode até mesmo levar à mislocalization dos complexos PPI.

Um fator adicional a considerar ao projetar experimentos BiFC-palma é o atraso na maturação cromóforo que é inerente a proteínas fluorescentes. Uma vez que duas proteínas interagem e os fragmentos de PF vêm juntos, eles tipicamente redobre na ordem de segundos (tempo de meia 60 seg para EYFP ^3). No entanto, a maturação e posterior cromóforo sinal fluorescente desenvolver na ordem de minutos. Embora a fluorescência pode ser detectável dentro de 10 min após a reconstituição de split-Vénus, uma variante rápido dobrar-YFP, a meia-hora para a maturação, em geral, é muitas vezes cerca de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 foi observada a ter taxas similares. Assim, BiFC e BiFC-PALM são escolhas atualmente pobres para monitorar cinética PPI em tempo real; outro methods, tais como a dimerização de FRET e uma recentemente desenvolvido proteína fluorescente dependente ^17, pode ser mais adequado para este fim.

Protocol

1. Clonagem Determinar as configurações para clonar e escolher um ligante. Proteínas Tag com os fragmentos no N- ou C-terminal, como descrito abaixo para que eles não perturbar a sua localização adequada. Use de um ligante flexível, tal como (GGGGS) x2. Geneticamente marcar as proteínas de interesse aos fragmentos PAmCherry1. Como uma opção, use os plasmídeos de clonagem incluídos na Lista de Materiais contendo fragmentos do RN (resíduos PAmCherry1 1-159) e RC (Met mais os resíduos PAm…

Representative Results

O exemplo BiFC-PALM mostrado é KRAS mutante G12D interagindo com os Ras domínio de ligação (RBD) de Craf (Figura 1A). Como discutido, a RN ou fragmentos RC não foram etiquetadas para o C-terminal de Ras porque iria perturbar a localização da membrana e, portanto, a actividade biológica de Ras. Isto reduziu as combinações possíveis de oito para quatro (Figura 1B). Cada um destes quatro combinações foi introduzido em células U2OS utilizando infecção lentiviral. As células…

Discussion

BiFC tem sido uma técnica vulgarmente utilizada para a detecção e a visualização de IPP em células, enquanto palma é uma técnica de microscopia recente única molécula SuperResolution que permite imagens em nanoescala de amostras biológicas intactas. A combinação de BiFC com PALM alcançado imagem seletiva de PPIs dentro de uma célula com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula. BiFC-PALM estende a utilidade de ambas as técnicas, e como demonstrado neste trabalho, mostra uma gran…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks