Etudier communautés microbiennes<em> In Vivo</em>: Un modèle d'interaction hôte intermédiaire Entre<em> Candida albicans</em> Et<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Dans les Airways

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Étude de l'interaction hôte-pathogène nous permet de comprendre les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité lors d'une infection microbienne. Le pronostic de l'hôte dépend de l'implication d'une réponse immunitaire adaptée contre l'agent pathogène ^1. Réponse immunitaire est complexe et les résultats de l'interaction des pathogènes et plusieurs types cellulaires immunitaires ou non immuns ^2. Des études in vitro ne peuvent pas caractériser ces interactions et de se concentrer sur les interactions cellulaires-pathogène. En outre, dans les voies respiratoires ^3, en particulier chez les patients atteints de maladie pulmonaire chronique purulente ou chez les patients ventilés mécaniquement, communautés polymicrobiennes sont présents et compliquent l'interaction hôte-pathogène. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes ^4, fréquemment isolés à partir d'échantillons trachéo-bronchique, et associée à des infections graves, en particulier en unité de soins intensifs ^5. Microbiens ont interactionsété signalés entre ces agents pathogènes in vitro, mais l'impact clinique de ces interactions reste incertaine ^6. Pour étudier les interactions entre C. Albicans et P. aeruginosa, un modèle murin de C. albicans colonisation des voies respiratoires, suivi d'un P. infection pulmonaire aiguë aeruginosa- médiation a été effectuée.

Introduction

Des modèles animaux, en particulier des souris, ont été largement utilisés pour étudier les réponses immunitaires contre des agents pathogènes. Bien que l'immunité innée et acquise diffèrent entre les rongeurs et les humains ^7, la facilité pour la reproduction et le développement des ouvertures pour de nombreux gènes, font souris un excellent modèle pour étudier les réponses immunitaires ^8. La réponse immunitaire est complexe et résulte de l'interaction d'un agent pathogène, la flore résidents microbiennes et plusieurs immunitaires (lymphocytes, les neutrophiles, les macrophages) et non-immunitaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales) types cellulaires ^2. Des études in vitro ne permet pas l'observation ces interactions complexes et se concentrent principalement sur les interactions uniques cellules pathogènes. Alors que les modèles animaux doivent être utilisés avec prudence et limitées à des questions très précises et pertinentes, des modèles de souris fournissent un bon aperçu de la réponse immunitaire des mammifères in vivo et peuvent porter sur des parties de ⁷ questions cliniques importantes.

<p class="jove_content"> dans les voies respiratoires, la communauté microbienne complexe associant est un grand nombre de micro-organismes différents ^6. Alors que ce qui constitue un microbiome des voies respiratoires "normale" reste à déterminer, les communautés résidentes sont souvent polymicrobiennes, et proviennent de diverses sources écologiques. Les patients atteints de maladie chronique suppurée pulmonaire (fibrose kystique, bronchectasies) ou les patients ventilés mécaniquement présentent une flore particulière en raison de la colonisation des voies aériennes par des microorganismes de l'environnement acquises ^9. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes ^5, souvent isolé ensemble à partir d'échantillons trachéo , et responsable d'infections opportunistes graves chez ces patients, en particulier dans l'unité de soins intensifs (USI) ^4.

Isolement de ces micro-organismes lors de la pneumonie aiguë dans les résultats de l'USI dans le traitement anti-microbienne contre P. aeruginosa but levure sont généralement pas considérés pathogène sur ce site ^5. interactions in vitro entre P. aeruginosa et C. albicans ont été largement publiées et a montré que ces micro-organismes peuvent affecter la croissance et la survie de l'autre, mais les études ne pouvaient pas conclure si la présence de C. albicans est nuisible ou bénéfique pour l'hôte ^10. Des modèles de souris ont été développés pour répondre à cette pertinence de P. aeruginosa et C. albicans in vivo, mais l'interaction entre les microorganismes n'a pas été le point clé. En effet, le modèle a été créé pour évaluer l'implication de C. albicans dans la réponse immunitaire de l'hôte, et le résultat.

Un modèle précédent établi par Roux et al déjà utilisé une colonisation initiale avec C. albicans suivie par une infection pulmonaire aiguë induite par P. aeruginosa. Grâce à leur modèle, les auteurs ont trouvé un rôle délétère de prieur C. albicans colonisation des ^11. Cependant Roux et al ont utilisé une charge élevée de C. albicans dans leur modèle avec 2 x 10 ⁶ UFC / souris pendant 3 jours consécutifs. Nous avons établi un modèle de 4 jours de C. albicans voies respiratoires colonisation, ou du moins sans la persistance des lésions pulmonaires, Dans ce modèle C. albicans a été récupéré jusqu'à 4 jours après l'instillation d'une seule de 10 ⁵ UFC par souris (figure 2B) ^12,13. Après 4 jours, aucune preuve de recrutement de cellules inflammatoires, production de cytokines inflammatoires, ni altération de l'épithélium a été observée. À 24 – 48 h, à la présence de pic de C. albicans, même si une réponse immunitaire innée cellulaire et cytokine a été observée, il n'y avait aucune preuve de lésions pulmonaires. De manière surprenante, les souris ainsi colonisés par C. albicans 48 h avant l'instillation intranasale de P. aeruginosa avait atténué l'infection par rapport à des souris avec P. aeruginosa infection seul. jen fait, les souris exposées lésion pulmonaire moindre et une diminution de la charge bactérienne ^12,13.

Plusieurs hypothèses pourraient expliquer cet effet bénéfique de la colonisation avant avec C. albicans sur P. aeruginosa médiée infection pulmonaire aiguë. D'abord, une diaphonie interspécifique impliquant chacun des microorganismes des systèmes de détection de quorum, le P. base homoserinelactone- et le système aeruginosa basé farnesol C- système albicans, ont été évalués. Deuxièmement, C. albicans agissant comme une cible "leurre" pour P. aeruginosa détourner l'agent pathogène à partir de cellules épithéliales pulmonaires a été étudiée. Les deux hypothèses ont été invalidés (données non publiées). La troisième hypothèse est celle d'un "amorçage" du système immunitaire inné de C. albicans responsable d'une réponse innée subséquente accrue contre P. aeruginosa. Cette dernière hypothèse a été confirmée. En effet C. albicans colonisation a conduit à un amorçage de l'immunité innée through IL-22, principalement sécrétée par les cellules lymphoïdes innées, ce qui entraîne une augmentation de la clairance bactérienne et réduit les lésions pulmonaires ^12.

En conclusion, l'hôte est un acteur central dans l'interaction entre les microorganismes modulant la réponse immunitaire innée et impliquant différents types de cellules inflammatoires. Bien que ces interactions immunitaires complexes peuvent être disséqués in vitro les hypothèses de départ ne peuvent être fournis par des mesures appropriées de modèles in vivo. Le protocole suivant fournit un exemple d'étude in vivo de l'agent pathogène interaction hôte-médiation qui peut être adapté à d'autres micro-organismes.

Protocol

Le comité régional d'éthique régional pour l'expérimentation animale a approuvé cette méthode, en conformité avec soin et l'utilisation des animaux national et international dans les lignes directrices de recherche expérimentaux. Collection 1. Echantillon Stockage des échantillons Recueillir tous les échantillons et immédiatement stocker à – 20 ° C ou sur de la glace jusqu'à ce que l'entreposage au congélateur pour éviter la détérior…

Representative Results

Comme vu précédemment lors de la description de protocole, l'expérience a besoin de 5 jours pour compléter (Figure 1: expérience timeline). Un opérateur est sollicité pendant la course entière de l'expérience et peut gérer les processus jusqu'à un maximum de 10 souris. Si plus d'animaux sont tenus, deux personnes sont nécessaires notamment pour la collecte de l'échantillon chirurgicale. En effet tous les échantillons doivent être prélevés en moins de 2 heures pour é…

Discussion

Modèles animaux, en particulier les mammifères, sont utiles pour élucider les mécanismes complexes d'interaction hôte-pathogène dans les domaines de l'immunité. Bien sûr, le besoin d'information obtenue uniquement à partir des modèles animaux doivent être essentielles; par ailleurs, l'utilisation d'animaux doit être remplacé par des modèles in vitro. Ce modèle animal illustre l'idée qui ne peut être fourni par un modèle animal puisque l'interaction entre les agents …

Materials

Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47%	CEVA	6742145	100 mL plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µL	Dutscher	10175	x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 mL
amikacin 1g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10 000 UI in 2 mL	Pan pharma	9128701	x 10 per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment