Summary

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em> In-vivo-</em>: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em> Candida albicans</em> Und<em> Pseudomonas aeruginosa</em> In den Atemwegen

Published: January 13, 2016
doi:

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Studieren Wirt-Pathogen-Interaktion ermöglicht es uns, die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität bei mikrobiellen Infektion zu verstehen. Die Prognose der Host davon abhängt, dass einer angepassten Immunantwort gegen das Pathogen 1. Immunantwort ist komplex und Ergebnisse aus der Interaktion der Erreger und verschiedene Immun- oder Nicht-Immunzelltypen 2. In-vitro-Studien kann nicht zeichnen diese Interaktionen und konzentrieren sich auf die Zell-Pathogen-Interaktionen. Darüber hinaus ist in dem Atemweg 3, besonders bei Patienten mit eitrigen chronischen Lungenerkrankungen oder bei beatmeten Patienten, vorliegen polymicrobial Gemeinden und komplizieren Wirt-Pathogen-Interaktion. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Probleme Pathogene 4, häufig tracheobronchial Proben isoliert, und bis schweren Infektionen, insbesondere in der Intensivstation 5. Mikrobielle Interaktionenzwischen diesen Erregern in vitro berichtet worden, aber die klinische Bedeutung dieser Wechselwirkungen bleibt unklar 6. Die Wechselwirkungen zwischen C. Albicans und P. studieren aeruginosa, ein Mausmodell der C albicans airways Kolonisierung, gefolgt von einem P. aeruginosa- vermittelten akuten Lungeninfektion durchgeführt wurde.

Introduction

Tiermodelle, vor allem Mäuse, wurden ausgiebig verwendet, um Immunantworten gegen Pathogene zu erkunden. Obwohl angeborenen und erworbenen Immunität unterscheiden zwischen Nagern und Menschen 7, die Leichtigkeit in der Züchtung und der Entwicklung von Knockouts für zahlreiche Gene, stellen Mäusen ein hervorragendes Modell, um Immunantworten 8 studieren. Die Immunreaktion ist komplex und resultiert aus der Wechselwirkung eines Erregers, die ansässigen mikrobiellen Flora und mehrere Immun (Lymphozyten, Neutrophilen, Makrophagen) und nicht-immune (Epithelzellen, Endothelzellen) Zelltypen. 2 In vitro-Untersuchungen erlauben nicht beobachtet Diese komplexen Interaktionen und vor allem auf einmalige zell Pathogen-Interaktionen. Während Tiermodelle müssen mit Vorsicht verwendet und auf sehr spezifische und relevante Fragen beschränken, bieten Mausmodellen einen guten Einblick in den Säuger-Immunantwort in vivo und können Teile der wichtigen klinischen Fragen 7 anzugehen.

<p class="jove_content"> in den Atemwegen ist die Mikrobengemeinschaft komplexe Bindung einer großen Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen 6. Während, was eine "normale" Atemwegs microbiome noch bestimmt werden, ansässig sind Gemeinden häufig polymikrobiellen, und stammen aus verschiedenen ökologischen Quellen. Patienten mit eitriger chronischer Lungenerkrankung (zystische Fibrose, bronchectasis) oder beatmeten Patienten weisen eine besondere Flora aufgrund der Besiedelung der Atemwege durch umwelt erworbene Mikroorganismen 9. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Problemerreger 5, häufig tracheobronchial Proben zusammen isoliert und verantwortlich für schwere opportunistische Infektion bei diesen Patienten, insbesondere in der Intensivstation (ICU) 4.

Isolation dieser Mikroorganismen während einer akuten Lungenentzündung auf der Intensivstation führt antimikrobielle Behandlung gegen P. aeruginosa but Hefe werden normalerweise nicht an dieser Stelle 5 als pathogen angesehen. In vitro Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa und C. albicans wurden weithin berichtet und gezeigt, dass diese Mikroorganismen das Wachstum und das Überleben von einander beeinflussen, aber Studien konnte nicht schließen, wenn die Anwesenheit von C. albicans ist schädlich oder nützlich für den Host 10. Mausmodelle wurden entwickelt, um dieses Relevanz von P. Adresse aeruginosa und C. albicans in vivo, aber die Wechselwirkung zwischen Mikroorganismen war nicht der entscheidende Punkt. In der Tat wurde das Modell etabliert, um die Beteiligung von C. bewerten albicans in Wirtsimmunantwort und Ergebnis.

Eine Vorgängermodell von Roux et al fest bereits eine erste Besiedlung mit C eingesetzt albicans, gefolgt von einer akuten Lungeninfektion durch P. induzierte aeruginosa. Mit ihrem Modell, fanden die Autoren eine schädliche Rolle von prior C. albicans Kolonisation 11. Allerdings verwendet Roux et al eine hohe Belastung von C. albicans in ihrem Modell mit 2 × 10 6 CFU / Maus während 3 aufeinanderfolgenden Tagen. Wir haben eine 4-Tage-Modell der C albicans Atemwege Kolonisierung oder zumindest Persistenz ohne Lungenverletzung, in diesem Modell C. albicans wurde bis zu 4 Tage nach einer einzelnen Instillation von 10 5 CFU pro Maus (2B) 12,13 abgerufen. Nach 4 Tagen wurden keine Beweise von entzündlichen Zellrekrutierung, entzündliche Zytokin-Produktion noch Epithelschädigung beobachtet. Bei 24 – 48 h, auf dem Höhepunkt Vorhandensein von C. albicans, obwohl eine zelluläre und Zytokin angeborenen Immunantwort beobachtet wurde, gab es keine Anzeichen einer Lungenverletzung. Überraschenderweise Mäusen so mit C. kolonisiert albicans 48 h vor dem Einträufeln der P. intranasale aeruginosa-Infektion hatte abgeschwächt im Vergleich zu Mäusen, die mit P. aeruginosa-Infektion allein. ichndeed zeigten Mäuse geringere Lungenschädigung und verminderte Bakterienlast 12,13.

Mehrere Hypothesen könnte diese positive Wirkung von vor Besiedlung mit C. erklären albicans auf P. aeruginosa vermittelten akuten Lungeninfektion. Zunächst wird eine Interspezies-Übersprechen mit jeweils Mikroorganismen Quorum-Sensing-Systeme, die homoserinelactone basierte P. aeruginosa-System und das Farnesol basierten C. albicans System wurden ausgewertet. Zweitens C. albicans als "Lockvogel" Ziel für P. aeruginosa Umleitung des Erregers aus Lungenepithelzellen handeln untersucht. Beide Hypothesen (unveröffentlichte Daten) für ungültig erklärt. Die dritte Hypothese war, dass der "Priming" des angeborenen Immunsystems durch C. albicans für eine verbesserte Folge angeborenen Antwort gegen P. verantwortlich aeruginosa. Diese letzte Hypothese wurde bestätigt. Tatsächlich C. albicans Kolonisierung führte zu einem Priming der angeborenen Immunität through IL-22, vor allem von angeborenen lymphoiden Zellen sezerniert wird, was zu einer erhöhten bakteriellen Clearance und einer verminderten Lungenverletzung 12.

Zusammenfassend ist der Host ein zentraler Akteur in der Interaktion zwischen Mikroorganismen Modulation der angeborenen Immunantwort und die verschiedene Entzündungszelltypen. Während diese komplexe Immun Wechselwirkungen können in vitro präpariert werden die anfänglichen Hypothesen kann nur durch geeignete In-vivo-Modellen zur Verfügung gestellt werden. Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel der in vivo-Untersuchung von Wirt-Pathogen-vermittelte Wechselwirkung, um andere Mikroorganismen angepasst werden kann.

Protocol

Die regionale Ethik-Regionalkomitee für Tierversuche hat diese Methode zugelassen, in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Tierpflege und die Verwendung in experimentellen Forschungs Richtlinien. 1. Probenentnahme Probenlagerung Sammeln Sie alle Proben und sofort speichern bei – 20 ° C oder auf Eis, bis Tiefkühllagerung, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Platzieren steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf Eis zu bronchoalveoläre Lavage (B…

Representative Results

Wie während der Protokollbeschreibung zuvor gesehen, muss das Experiment 5 Tage auf (Abbildung 1: Experiment Timeline) zu vervollständigen. Ein Bediener während der gesamten Lauf des Experiments angeforderter und die Prozesse bis zu einem Maximum von 10 Mäusen Griff nach oben. Wenn mehrere Tiere erforderlich ist, werden zwei Personen besonders für chirurgische Probennahme erforderlich ist. In der Tat alle Proben müssen in weniger als 2 Stunden gesammelt werden, um eine erhöhte passive alveolären…

Discussion

Tiermodelle, insbesondere Säugetieren, nützlich sind, um komplexe Mechanismen der Wirt-Pathogen-Wechselwirkung in den Bereichen Immunität aufzuklären. Natürlich ist der Informationsbedarf, erhältlich nur aus Tiermodellen müssen wesentlich sein; Andernfalls muss die Verwendung von Tieren durch In-vitro-Modelle ersetzt werden. Dieses Tiermodell zeigt die Erkenntnis, dass nur von einem Tiermodell zur Verfügung gestellt werden kann, da die Wechselwirkung zwischen Pathogene wird durch Reaktion eines mehrkomp…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).

Materials

Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47% CEVA 6742145 100 mL plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µL Dutscher 10175 x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 mL
amikacin 1g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10 000 UI in 2 mL Pan pharma 9128701 x 10 per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

Referências

  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).

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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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