संवहनी सेल remodeling के जांच के लिए शारीरिक के इन विट्रो मॉडल और आवेदन के साथ रोग रक्त के प्रवाह में
Summary
इस प्रोटोकॉल रोग विकृतियों में सेल प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में सहायता करने के लिए इन विट्रो में शारीरिक या रोग रक्त के प्रवाह को दोहराता है। एक रक्त पंप के बहाव के चैम्बर भिगोना एक दबाव को शुरू करके, वाहिका भर में रक्त के प्रवाह को recapitulated जा सकता है और नाड़ी अन्तःचूचुक या एक अनुकरण करनेवाला सह संस्कृति की एक monolayer पर लगाया।
Abstract
रोग संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का एक आम कारण है। इस के साथ साथ, हम रोग विकृतियों की ओर प्रवाह की गतिशीलता के योगदान की जांच करने के लिए एक तरीका मौजूद है। दीवार stiffening, जख्म, या सभी तरल पदार्थ के प्रवाह की दर को प्रभावित कर सकता है जो आंशिक एक प्रकार का रोग है, और गुणवाला प्रवाह की भयावहता, या pulsatility सूचकांक के साथ अक्सर मौजूद अस्वस्थ धमनियों। विभिन्न प्रवाह की स्थिति की प्रतिकृति एक रक्त पंप के बहाव के चैम्बर भिगोना एक प्रवाह दबाव ट्यूनिंग का परिणाम है। एक सिकुड़ाया मध्यम पंप से गुणवाला दबाव को अवशोषित, और इसलिए pulsatility सूचकांक भिन्न करने के लिए एक बंद प्रवाह प्रणाली के भीतर हवा का परिचय देता है। इस के साथ साथ वर्णित विधि बस अत्यधिक चलाया इनपुट, और आसानी से मध्यम श्रेणी का परिणाम के साथ reproduced है। कुछ सीमाओं में ही प्रणाली द्वारा अनुमानित है, जो जटिल शारीरिक नाड़ी तरंग, का मनोरंजन कर रहे हैं। Endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, और fibroblasts रक्त के प्रवाह के लिए thr से प्रभावित हैंधमनी Ough। रक्त के प्रवाह के गतिशील घटक कार्डियक आउटपुट और धमनियों की दीवार के अनुपालन से निर्धारित होता है। प्रवाह की गतिशीलता के संवहनी सेल Mechano पारगमन साइटोकाइन जारी है और धमनी के भीतर प्रकार की कोशिकाओं के बीच परस्पर बात को गति प्रदान कर सकते हैं। नाड़ी कोशिकाओं के सह संस्कृति रक्त वाहिनियों की दीवार और यांत्रिक सिगनल को संवहनी प्रतिक्रिया पर एक अधिक सटीक तस्वीर को दर्शाती सेल सेल बातचीत है। प्रवाह के गतिशील और मतलब (या स्थिर) घटकों के लिए सेल प्रतिक्रिया सहित प्रवाह की गतिशीलता के योगदान, इसलिए रोग विकृति और उपचार प्रभावकारिता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है। इन विट्रो सह संस्कृति मॉडल को शुरू करने और दबाव नकली कार्डियक आउटपुट पैदा करता है जो रक्त पंप के बहाव भिगोना के माध्यम से, विभिन्न धमनी रोग विकृतियों की जांच की जा सकती है।
Introduction
हृदय रोगों के लिए रुग्णता दरों कई अस्वस्थ वाहिका से उत्पन्न के साथ, अमेरिका में सबसे बड़े हैं। स्वस्थ धमनियों एक endothelial सेल (ईसी) monolayer साथ लेपित मुलायम ल्यूमिनल सतह के साथ, लोचदार ऊतक से मिलकर बनता है। धमनी प्रवाह सकारात्मक मतलब प्रवाह की दर के साथ एक oscillating लहर समारोह के रूप में मॉडलिंग की जा सकती है। pulsatility सूचकांक (पीआई) दोलन परिमाण का भागफल और मतलब प्रवाह (।। पीआई = (अधिकतम – मिन) / माध्य) है, एक और चर पोत लोच के साथ इन विट्रो में मॉडलिंग कर दिया गया है 2 धमनी लोच प्रवाह के भंडारण में महत्वपूर्ण है। दिल संकुचन से ऊर्जा, सिस्टोलिक दबाव में विस्फारित, और रक्त प्रवाह में गड़बड़ी नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दिल एक सुसंगत, गुणवाला, बड़ा प्रवाह को बनाए रखता है क्योंकि, धमनी विस्तार प्रवाह वेग, कतरनी तनाव, और पीआई को कम करने से प्रवाह स्थिरता बढ़ाने, पार के अनुभागीय क्षेत्र बढ़ जाती है। लोच के लिए अक्सर अस्वस्थ धमनियों वर्तमान परिवर्तनया अनुपालन, संवहनी remodeling, निशान ऊतक या कड़ा हो जाना 3, 4 से stiffening प्रदर्शित। इसके अतिरिक्त, ऐसे neointimal हाइपरप्लासिया (एनआईएच), 5 धमनीविस्फार और उच्च रक्तचाप के 6 और नाड़ी फाइब्रोसिस के रूप में 4 अन्य संवहनी विकारों, पोत व्यास कसना सकता है। हालांकि, मौजूदा दवा उपचार और संवहनी रोगों की युक्ति उपचार अक्सर अक्सर पोत आकृति विज्ञान और गुणों में परिवर्तन से जटिल है, जो रोग में पोत दीवार अनुपालन या रक्त प्रवाह की गतिशीलता के महत्व की उपेक्षा। न तो बैलून एंजियोप्लास्टी और न ही स्टेंटिंग दीवार लोच 7 की जटिलता का जवाब। इसलिए, खून की इन विट्रो मॉडलिंग धमनी रोग और उपचार से उत्पन्न बहती रोग विकृतियों और उपचार के भविष्य के प्रभावकारिता की जांच में महत्वपूर्ण है। इस के साथ साथ, हम रोग pathol में सेल प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए बनाया गया शारीरिक और रोग रक्त के प्रवाह को नकल करने की एक विधि का वर्णनogies। द्रव का प्रवाह वाहिका के भीतर सभी कोशिकाओं को प्रभावित करने, पोत स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण यांत्रिक संकेत है जो पोत दीवार, पर कतरनी तनाव का कारण बनता है। तरल पदार्थ कतरनी के लिए संवहनी अन्तःचूचुक पर कई यांत्रिक सेंसर एन्दोथेलिअल 8 mechanosensing के लिए हाल ही में एक अध्ययन में दिखाया प्राथमिक बरौनी सहित पहचान की गई है। Endothelial सेल गतिविधि और आकृति विज्ञान प्रवाह वेग, दिशा, और pulsatility से प्रभावित हैं। इसके अतिरिक्त, चिकनी पेशी सेल (एसएमसी) प्रवास मध्य द्रव 9 के माध्यम से कम वेग प्रवाह की Mechano-संकेतों से प्रभावित किया जा सकता है, और भी प्रवाह और साइटोकाइन के माध्यम से प्रवाह संकेतों के Mechano पारगमन के लिए उनकी प्रतिक्रिया के माध्यम से endothelial कोशिकाओं से पैराक्राइन संकेत के माध्यम से किया जा सकता है 10 रिलीज। मतलब कतरनी, पीआई, और पैराक्राइन सिगनल की "खुराक" निर्भरता भी दूसरे पर आश्रित हो सकता है। Monolayer संस्कृति में यह अंत, विभिन्न "खुराक" के साथ तरल पदार्थ कतरनी को संवहनी सेल प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिएया इन विट्रो में सह संस्कृति संवहनी पुर्ननिर्माण में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और रोग और उपचार भविष्यवाणी सुधार सकता है। इस प्रयोग में इस्तेमाल प्रवाह प्रणाली एक रक्त पंप, एक नदी के ऊपर प्रवाह भिगोना हवा जलाशय, केवल प्रयोगात्मक स्थापना, एक बहाव सेल संस्कृति, समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर, और मीडिया जलाशय के दौरान इस्तेमाल एक बहाव फ्लो मीटर के होते हैं। , प्रवाह दर का मतलब है जैसे संवहनी प्रवाह चर का नियंत्रण प्रति मिनट धड़कता है, और पीआई नियंत्रित प्रवाह की दर, नाड़ी आवृत्ति, और दबाव की शुरूआत भिगोना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। गुणवाला रक्त पंप बड़ा प्रवाह की दर, और नाड़ी आवृत्ति मतलब के लिए सीधे संबंधित है, नियंत्रित स्ट्रोक आवृत्ति पर, चर स्ट्रोक विस्थापन के साथ उपलब्ध हैं। प्रवाह सर्किट के भीतर एक हवा जलाशय का परिचय प्रवाह दोलन भयावहता को कम करने, दबाव भिगोना के लिए अनुमति देता है। भिगोना कक्ष के भीतर हवा होने का प्रवाह लहर से अतिरिक्त दबाव अनुमति देता है, सिकुड़ाया है, जबकि मीडिया, एक असंपीड्य द्रव हैहवा संपीड़न द्वारा अवशोषित। मीडिया अनुपात करने के लिए हवा में ज्यादा भिगोना कैसे होता है पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। चौड़ाई में 50 मिमी से लंबाई में 75 मिमी एक कस्टम सेल संस्कृति प्रवाह कक्ष एक्रिलिक से बनाया गया था। प्रवाह इनलेट पोर्ट के माध्यम से प्रवेश करती है, और प्रवाह कक्ष की सम्पूर्णता भर में लगातार प्रवाह प्रदान करने, इनलेट कई गुना के माध्यम से फैलता है। इसी प्रवाह और संरचनाओं चैम्बर दुकान पर मौजूद हैं। प्रकोष्ठों क्रियाशील स्लाइड्स पर वरीयता प्राप्त, और बाद में प्रवाह कक्ष से जुड़े होते हैं। यह आसानी से अध्ययन के बाद लिया गया बड़ी आबादी के लिए अनुमति देता है। सह संस्कृति प्रयोगों साइटोकाइन / प्रवाह परिवहन की अनुमति है जबकि संस्कृतियों के बीच सेल करने वाली सेल संपर्क समाप्त करने के लिए एक झरझरा पॉली कार्बोनेट झिल्ली उपयोग कर सकते हैं। यह प्रणाली पहले से, उच्च गड़बड़ी प्रवाह और endothelial monolayer संस्कृति और चुनाव आयोग / एसएमसी सह संस्कृति 1, 10 पर उसके प्रभाव मॉडल करने के लिए सेल प्रतिक्रिया के लिए विकृतिविज्ञानी उच्च गड़बड़ी की बीमारी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन प्रवाह चोर मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन करकेditions, हम प्रतिक्रिया सेल प्रवाह संकेत योगदान का निर्धारण करने में दूसरों की सहायता करने के लिए उम्मीद है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में गुणवाला प्रवाह reproducing की एक विधि का वर्णन है, और रोग विकृतियों को प्रवाह की स्थिति के योगदान को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई पहला कदम हो सकता है। इस प्रोटो…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों (डब्ल्यूटी को HL097246 और HL119371) अहा (डब्ल्यूटी को 13GRNT16990019) और NHLBI सहित धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Referências
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