In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering
Summary
Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom de vitro te helpen bij het bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.
Abstract
Vaatziekten is een veel voorkomende doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Hierin presenteren we een methode om de bijdrage van stromingsdynamica richting vaatziekte pathologieën onderzoeken. Ongezonde slagaders vaak aanwezig met wand verstijving, littekens of gedeeltelijk stenose die allen invloed vloeistofstroomsnelheden en de omvang van de pulserende stroom of pulsatility index. Replicatie van verschillende stromingsomstandigheden is het resultaat van stemmen van een stromingsdruk rustkamer stroomafwaarts van een bloedpomp. Inbrengen van lucht in een gesloten stroom systeem zorgt voor een samendrukbaar medium tot pulserende druk absorberen uit de pomp, en daarom variëren de pulsatility index. De hierin beschreven werkwijze is eenvoudig gereproduceerd met hoge beheersing ingang en gemakkelijk meetbare resultaten. Sommige beperkingen recreatie van de complexe fysiologische pulsgolfvorm, die alleen benaderd door het systeem. Endotheelcellen, gladde spiercellen en fibroblasten worden beïnvloed door de bloedstroom thrdoorgedreven de slagader. De dynamische component van de bloedstroom wordt bepaald door het hartminuutvolume en vaatwand compliance. Vasculaire cel mechanisch-transductie van stroom dynamiek kan cytokineafgifte en cross-talk tussen celtypen binnen de slagader veroorzaken. Co-kweek van vasculaire cellen een nauwkeuriger beeld reflecterende cel-cel interacties aan de bloedvatwand en vasculaire respons op mechanische signalering. Bijdrage van stromingsdynamica, inclusief de celrespons op de dynamische gemiddelde (of constante) componenten van stroom, is daarom een belangrijke maatstaf bepalen pathologie en behandeling werkzaamheid. Door het introduceren van een in vitro co-cultuurmodel en druk demping stroomafwaarts van bloed pomp die gesimuleerde cardiale output produceert, kunnen verschillende vaatlijden pathologieën onderzocht.
Introduction
Ziektecijfers voor hart- en vaatziekten zijn de grootste in Amerika, met veel als gevolg van ongezonde vaatstelsel. Gezonde bloedvaten bestaan uit elastisch weefsel, zachte luminale oppervlak bedekt met een endotheelcel (EC) monolayer. Arteriële stroom kan worden gemodelleerd als een oscillerende golffunctie met positieve gemiddelde debiet. De pulsatility index (PI) is het quotiënt van oscillatie omvang en gemiddelde stroomsnelheid (PI = (max -.. Min) / gemiddelde), 1 en is gemodelleerd in vitro met variabele elasticiteit vat 2 arteriële elasticiteit van belang voor de opslag van stroom. energie uit hart contracties, verwijden onder systolische druk, en speelt een belangrijke rol bij het moduleren van de bloedstroom PI. Omdat het hart handhaaft een constante, pulsatiele, volumestroom, arteriële expansie verhoogt dwarsdoorsnede, verbetering stroming stabiliteit door het verminderen van stroomsnelheid, schuifspanning en PI. Vaak ongezonde slagaders huidige veranderingen in de elasticiteitof compliance, het weergeven van verstijving van vasculaire remodeling, littekenweefsel of calcificatie 3, 4. Bovendien kunnen andere vaataandoeningen, zoals neointima hyperplasie (NIH), aneurysma 5 pt 6 hypertensie en vasculaire fibrose 4, diameter vat vernauwen. Echter, de huidige behandeling met geneesmiddelen en het apparaat de behandeling van vasculaire ziekten verwaarlozen vaak het belang van een vaatwand naleving of de bloedstroom dynamiek in vasculaire ziekte die vaak wordt gecompliceerd door veranderingen in het vat morfologie en eigenschappen. Noch ballondilatatie of stenting beantwoorden complicatie van wand 7 elasticiteit. Daarom is in vitro modellen van bloedstromen gevolg van arterieel vaatlijden en behandelingen van belang bij onderzoek ziekte pathologieën en toekomstige effectiviteit van de behandeling. Hierin beschrijven we een werkwijze voor het repliceren van fysiologische en pathologische bloedstroom ontworpen celreactie in vaatziekte Pathol bepalengieën. Vloeistofstroom veroorzaakt schuifspanning in de vaatwand, wat een belangrijk mechanisch signaal in gezond vat, die alle cellen binnen het vaatstelsel. Verschillende mechanische sensoren op het vasculaire endotheel voor vloeistofschuifspanning geïdentificeerd, zoals getoond in recente studies endotheliale mechanosensing 8 primaire cilium. Endotheliale celactiviteit en morfologie worden beïnvloed door stroomsnelheid richting en pulsatiliteit. Bovendien kan gladde spiercel (SMC) migratie beïnvloed door mechanisch-signalen van lage snelheid stroom door interstitiële vloeistof 9, en kunnen ook via de paracrienen van endotheliale cellen door hun reactie te stromen en mechanisch-transductie van stromingssignalen via cytokine 10 los. De "dosis" afhankelijk van de gemiddelde shear, PI en paracriene signalering kunnen ook van elkaar afhankelijk zijn. Daartoe de bepaling van vasculaire celrespons op vloeistofschuifspanning met gevarieerde "dosering" in monolaagkweekof co-cultuur de vitro kon mechanistische inzichten in vasculaire remodeling en verbetering van de ziekte en de behandeling voorspelling. Het stroomsysteem in dit experiment omvat een bloedpomp, een stroomopwaartse stromingsdemping luchtreservoir, een stroomafwaartse flowmeter alleen gebruikt tijdens de experimentele opstelling, een stroomafwaarts celcultuur, parallelle plaat stroming kamer en media reservoir. Controle van vasculaire stroming variabelen zoals betekenen debiet beats per minuut en PI kan worden bereikt door het regelen stroomsnelheid, pulsfrequentie, en invoering van de druk demping. Pulserende bloed pompen zijn leverbaar met een variabele slag verplaatsing, op gecontroleerde slagfrequentie, die rechtstreeks verband houden met volumestroom en polsslag bedoelt. Invoering van een lucht reservoir binnen de stroom circuit zorgt voor druk demping, waardoor de stroom oscillatie omvang. Media is een onsamendrukbare vloeistof, terwijl de lucht in de rustkamer samendrukbaar, waardoor overdruk uit de stroom golf te zijngeabsorbeerd door de lucht compressie. De lucht in de media-ratio zorgt voor controle over hoeveel demping optreedt. Een aangepaste celcultuur stromingskamer 75 mm in de lengte met 50 mm in de breedte is gemaakt van acryl. Flow komt via de inlaat poort, en breidt door het inlaatspruitstuk, consistente stroom over het geheel van de stroom kamer. Vergelijkbare flow en structuren zijn aanwezig op kameruitlaat. Cellen worden gezaaid gefunctionaliseerd slides, en vervolgens bevestigd aan de stromingskamer. Dit zorgt voor grote populaties gemakkelijk teruggevonden na de studie. Co-kweek-experimenten kan een poreus membraan van polycarbonaat om cel-tot-cel contact tussen culturen elimineren terwijl cytokine / stroom transport. Dit systeem is eerder gebruikt om in hoge PI doorstroming en het effect op endotheliale monolaag cultuur en EC / SMC co-kweek 1, 10, tot celrespons op pathologisch hoge PI ziekte te onderzoeken. Met een beschrijving van het protocol dat wordt gebruikt voor het modelleren van deze stroom convoorwaarden, hopen we anderen helpen bij het bepalen bijdrage stroom signaal reactie cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het reproduceren pulserende stroming de vitro, en kunnen instrumenteel eerste stap bij het bepalen van de bijdrage stroomomstandigheden ziekte pathologieën. Vorige studies met behulp van dit protocol hebben gevonden stroom voorwaarden bijdragen aan vasculaire ontstekingsreactie. 1, 10 Bovendien, dit protocol is bedoeld voor ervaren laboratoria. Als zodanig, noch grondig vloeistofmechanica, of biochemische analyse wordt hierin beschreven. Voor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen financieringsbronnen, met inbegrip van AHA (13GRNT16990019 aan WT) en NHLBI (HL097246 en HL119371 om WT) te erkennen.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Referências
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
