في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية
Summary
هذا البروتوكول يعيد الفسيولوجية أو المرضية تدفق الدم في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض المرض. عن طريق إدخال ضغط التخميد غرفة المصب مضخة الدم، وتدفق الدم عبر الأوعية الدموية ويمكن تلخيصها وفرضت على أحادي الطبقة من بطانة الأوعية الدموية أو المحاكاة ثقافة مشتركة.
Abstract
أمراض الأوعية الدموية هو سبب شائع للوفاة في الولايات المتحدة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لدراسة مساهمة ديناميكية تدفق نحو الأمراض أمراض الأوعية الدموية. الشرايين غير صحية غالبا ما تكون موجودة مع تشنج الجدار، تندب، أو تضيق جزئي والتي قد تؤثر على جميع معدلات تدفق السوائل، وحجم تدفق نابض، أو مؤشر pulsatility. تكرار ظروف تدفق مختلف هو نتيجة لضبط ضغط تدفق التخميد غرفة المصب مضخة الدم. إدخال الهواء داخل نظام تدفق مغلقة تسمح وسيلة للانضغاط على امتصاص ضغط نابض من المضخة، وبالتالي تختلف مؤشر pulsatility. الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة ويرد بكل بساطة، مع إدخال السيطرة عليها إلى حد كبير، ونتائج قابلة للقياس بسهولة. بعض القيود هي الترفيه من التعقيد الفسيولوجية الموجي النبض، والذي يقترب فقط من قبل النظام. تتأثر الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية من قبل عبتي تدفق الدمough الشريان. يتم تحديد العنصر الديناميكي لتدفق الدم عن طريق الانتاج وجدران الشرايين القلبية الامتثال. الأوعية الدموية خلية والميكانيكية تنبيغ ديناميكية تدفق قد تؤدي إلى إطلاق سراح خلوى وعبر الحديث بين أنواع الخلايا داخل الشريان. شارك في ثقافة من خلايا الأوعية الدموية هي صورة تعكس أكثر دقة التفاعل خلية خلية على جدار الأوعية الدموية والأوعية الدموية استجابة لإشارات الميكانيكية. مساهمة ديناميكية تدفق، بما في ذلك استجابة الخلية إلى عناصر دينامية ويعني (أو ثابتة) من التدفق، وبالتالي فهو مقياس مهم في تحديد علم الأمراض وفعالية العلاج. من خلال إدخال في المختبر نموذج التعاون ثقافة وضغط التخميد المصب من ضخ الدم الذي ينتج النتاج القلبي محاكاة، قد يتم التحقيق مختلف الأمراض مرض الشرايين.
Introduction
معدلات الإصابة بالأمراض لأمراض القلب والشرايين هي الأكبر في أميركا، مع ما يترتب على كثير من الأوعية الدموية غير صحية. تتكون الشرايين سليمة من الأنسجة المرنة، مع سطح اللمعية الناعمة المغلفة مع خلية البطانية (EC) أحادي الطبقة. قد تكون على غرار تدفق الدم باعتبارها وظيفة موجة تتأرجح مع معدل تدفق متوسط إيجابي. مؤشر pulsatility (PI) هو حاصل من حجم التذبذب ويعني تدفق (PI = (ماكس – مين) / متوسط) (1)، وقد غرار في المختبر مع مرونة الأوعية متغير 2 الشرياني مرونة مهمة في تخزين التدفق. الطاقة من انقباضات القلب، معلقا تحت ضغط الانقباضي، وتلعب دورا هاما في تحوير PI تدفق الدم. لأن يحافظ على قلب ثابت، نابض، التدفق الحجمي، وتوسيع الشرايين ويزيد من مساحة العابرة للقطاعات، وتعزيز الاستقرار عن طريق الحد من تدفق سرعة تدفق، إجهاد القص، وPI. في كثير من الأحيان، والتغيرات الشرايين غير الصحية الحالية للمرونةأو الامتثال، وعرض تشنج من إعادة الأوعية الدموية، وندبا أو تكلس 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، واضطرابات الأوعية الدموية الأخرى، مثل تضخم neointimal (NIH)، 5 تمدد الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم وتليف الأوعية الدموية 6 4، قد انقباض قطر السفينة. ومع ذلك، العلاج من تعاطي المخدرات الحالية ومعالجة الجهاز من أمراض الأوعية الدموية في كثير من الأحيان يتجاهلون أهمية الامتثال جدار الوعاء الدموي أو تدفق الدم ديناميكية في أمراض الأوعية الدموية التي كثيرا ما تتسبب بتغيرات في التشكل السفينة والممتلكات. لا قسطرة البالون ولا الدعامات لرد على مضاعفات جدار مرونة 7. لذلك، في المختبر نمذجة تدفق الدم الناتج عن أمراض الشرايين وعلاجات مهمة في التحقيق في الأمراض المرض وفعالية في المستقبل من العلاج. هنا، نحن تصف طريقة تكرار الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم تهدف إلى تحديد استجابة الخلايا في pathol أمراض الأوعية الدمويةogies. يسبب تدفق السوائل إجهاد القص في جدار الوعاء الدموي، وهي إشارة الميكانيكية الهامة في مجال الصحة السفينة، مما يؤثر على كل الخلايا داخل الأوعية الدموية. وقد تم تحديد عدد من أجهزة الاستشعار الميكانيكية على بطانة الأوعية الدموية للالقص السوائل، بما في ذلك هدب الأساسي هو مبين في الدراسات الحديثة عن البطانية mechanosensing 8. تتأثر نشاط الخلايا البطانية والتشكل من خلال سرعة تدفق والتوجيه، وpulsatility. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر خلايا العضلات الملساء (SMC) الهجرة عن طريق الاشارات والميكانيكية من انخفاض سرعة تدفق من خلال الخلالي السوائل 9، ويمكن أيضا أن تكون من خلال الإشارات نظير الصماوي من الخلايا البطانية من خلال استجابتها لتدفق ووالميكانيكية تنبيغ إشارات التدفق عبر خلوى الإفراج عن 10. و"جرعة" اعتماد القص نفسه، PI، ويشير نظير الصماوي قد تكون مترابطة أيضا. تحقيقا لهذه الغاية، وتحديد استجابة الخلايا الوعائية إلى القص السوائل مع متنوعة "الجرعات" في الثقافة أحادي الطبقةأو زملاء الثقافة في المختبر يمكن أن توفر رؤى الآلية في إعادة الأوعية الدموية وتحسين المرض والتنبؤ العلاج. نظام تدفق المستخدمة في هذه التجربة يتكون من مضخة الدم، تدفق التخميد خزان الهواء المنبع، تدفق متر المصب يستخدم فقط أثناء الإعداد التجريبية، ثقافة الخلية المصب، موازية لوحة غرفة تدفق، وخزان وسائل الإعلام. السيطرة على المتغيرات تدفق الأوعية الدموية مثل يعني معدل التدفق، يدق في الدقيقة الواحدة، ويمكن أن يتحقق من خلال PI السيطرة على معدل التدفق، وتواتر النبض، وإدخال ضغط التخميد. هي مضخات الدم نابض المتاحة مع نزوح السكتة الدماغية متغير، في تواتر السكتات الدماغية التي تسيطر عليها، تتصل مباشرة يعني معدل التدفق الحجمي، وتواتر النبض. مقدمة من خزان الهواء داخل الدائرة تدفق يسمح للضغط التخميد، والحد من حجم التذبذب التدفق. وسائل الإعلام هو سائل غير قابل للإنضغاط، في حين أن الهواء داخل غرفة التخميد هو انضغاط، مما يسمح للضغط الزائد من موجة تدفق لتكونتمتصه ضغط الهواء. الهواء لنسبة وسائل الإعلام يسمح للسيطرة على كيفية حدوث الكثير من التخميد. تم إنشاء مخصص الثقافة خلية تدفق غرفة 75 ملم في الطول بمقدار 50 ملم في العرض من الاكريليك. يدخل التدفق من خلال مدخل الميناء، ويوسع من خلال فتحة متعددة، وتوفير تدفق ثابت عبر مجمل غرفة التدفق. تدفق وهياكل مماثلة موجودة في منفذ الغرفة. هي المصنفة الخلايا على الشرائح functionalized، وتعلق بعد ذلك إلى غرفة التدفق. وهذا يسمح لعدد كبير من السكان واسترجاعها بسهولة بعد الدراسة. تجارب المشارك الثقافة قد تستخدم غشاء البولي يسهل اختراقها للقضاء على اتصال خلية الى خلية بين الثقافات بينما يسمح النقل خلوى / التدفق. وقد سبق استخدام هذا النظام لنمذجة تدفق PI عالية وتأثيره على الثقافة أحادي الطبقة البطانية وEC / SMC شارك في الثقافة 1، 10، للتحقيق في استجابة الخلايا للأمراض PI عالية بشكل مرضي. من خلال وصف بروتوكول يستخدم لنمذجتها يخدع تدفقditions، ونأمل في مساعدة الآخرين في تحديد مساهمة إشارة تدفق إلى استجابة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعادة إنتاج تدفق نابض في المختبر، ويمكن أن يكون خطوة أولى مفيدة في تحديد مساهمة ظروف تدفق لأمراض المرض. وقد وجدت دراسات سابقة باستخدام هذا البروتوكول تساهم ظروف التدفق إلى الاستجابة الالتهابية الأوعية الدموية. 1، 10 بالإضافة إلى ذ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نعترف مصادر التمويل، بما في ذلك AHA (13GRNT16990019 إلى WT) وNHLBI (HL097246 وHL119371 لWT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Referências
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
