This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
I 2006 blev en ny tilgang, der er beskrevet til at omprogrammere somatiske celler i en pluripotent tilstand. Efter præ-screening af en vifte af potentielle omprogrammering faktorer musefibroblaster kan med held omdannes til såkaldte inducerede pluripotente stamceller (IPS) efter retroviral transduktion og overekspression af fire transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Efterfølgende denne teknik har effektivt blevet reproduceret brug af somatiske celler fra forskellige pattedyrarter, herunder mennesker 2, aber 3, rotter 4, hunde 5, får 6 og grise 7. Desuden ændrede protokoller udelade eller udskiftning af potentielt onkogene transkriptionsfaktor c-myc er blevet offentliggjort 8, 9.
Uanset den indledende omprogrammering nærmer sande pluripotens af voksende kolonier skal bekræftes, en møjsommelig og tidskrævende opgave. En væsentlig ulempeaf de fleste af disse analyser er, at de ikke kan udføres på levende celler. Etablerede pluripotens faktorer såsom OCT4, SOX2, NANOG eller REX1 repræsenterer transkriptionsfaktorer placeret i kernen og deres påvisning kræver fiksering af cellerne forud for immunhistokemi eller cellelyse til RT-PCR-analyse 10 -. 12 Derefter disse celler tabt for fremtiden eksperimenter kræver gentagne kulturer af hver koloni.
Således er en teknologi til at analysere pluripotens på levende celler er meget ønskeligt. Adskillige fremgangsmåder kan faktisk udføres direkte på levende celler under anvendelse af antistoffer rettet mod membran-baserede antigener (f.eks. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescerende farvestoffer rapporteret at detektere alkalisk phosphatase 13 eller små molekyler, som specifikt navngive embryostam (ES) og iPS celler 14. Dog kan antistofferne imidlertid påvirke cellerne og hver method er begrænset til en enkelt pluripotency markør. Endelig fluorescerende molekylære beacons, dual-antisense-oligonukleotider med hårnålestrukturer, der tillader levende farvning af celler, er blevet beskrevet 15. Selv om denne fremgangsmåde kan anvendes til mange gener, teknikken kræver nucleofection af en enkelt cellesuspension, hvilket ikke gælder for voksende iPS kolonier.
Et par år siden gen-specifikke nanopartikler er blevet beskrevet til at analysere survivin udtryk i humane SKBR3 brystkræftceller 16. Dette manuskript beskriver en roman innovativ tilgang til at opdage pluripotens markører i levende ES og iPS celler ved brug af guld nanopartikel konjugater. Disse nanopartikler består af en central guldpartikler med en koblet capture streng bærer den komplementære RNA-sekvens og en Cy3-mærket reporter streng. Det fluorescerende signal af reporter-strengen standses ved centrale guldpartikler. Derudover passendenanopartikler tjene som negative og positive kontroller, henholdsvis (figur 1). For et program nanopartiklerne er simpelthen tilsættes til dyrkningsmediet (figur 2) og ind i cellerne via endocytose (figur 3). Hvis målet RNA udtrykkes det forskyder reporter streng, som derefter udsender et fluorescerende signal. Denne metode kræver ikke manipulation af målcellen og ekspressionen af målgenet kan overvåges optisk under et fluorescensmikroskop direkte i levende celler. Endvidere kan teknologien anvendes til enhver ønsket målgen på tværs af arter i tilfælde af iPS-celler og således kan anvendes i mange forskellige forskningsområder. Endelig flowcytometrisk analyser muliggøre identifikation og berigelse af Cy3 positive celler.
Den foreliggende arbejde beskriver anvendelsen af fluorescensmærkede nanopartikler, der tillader pålidelig vurdering af intracellulær genekspression direkte i levende celler fra forskellige pattedyrarter med forskellige histogenetic oprindelse under et fluorescensmikroskop. Denne fremgangsmåde har et par fordele i forhold til andre offentliggjorte fremgangsmåder. Først og fremmest forskeren er ikke begrænset med hensyn til enten målgenet eller celletype. Alle antistof baserede detektionsmetoder er begrænset til en enkelt epitop. Selv fluorescerende molekylære beacons også kan være konstrueret til et bredt spektrum af gener, kræver denne fremgangsmåde dissociation af cellerne og efterfølgende nucleofection 15. Derimod har anvendelsen af gen-specifikke nanopartikler ikke nogen manipulation af target celle, som opsluger nanopartiklerne aktivt ved endocytose. Under den efterfølgende passage guldpartiklerne gradvist forlader cellerne og kulturen kan anvendes i downstream eksperimenter.
Alligevel teknologien også stadig har nogle begrænsninger. Nogle markører er naturligvis ikke påvises på grund af deres kulhydrat natur såsom SSEA-1 eller TRA-1-81 20. På nuværende tidspunkt, en bred vifte af nanopartikler er kommercielt tilgængelig. Disse partikler er blevet håndstestet for deres funktionalitet i cellulære eksperimenter. Formålet med det foreliggende arbejde var at designe tilpassede prober, der kan anvendes på tværs af arter grænser. Når du følger en sådan tilgang, eller når designe en sonde til et nyt target gen skal man være opmærksom på, at funktionaliteten af en i silico forudsagt sonden skal evalueres grundigt in vitro. Den NANOG-SF3 probe, som viste en 100% homologi til sekvenshomologien virkede ikke på alle, mens NANOG-SF1 med én uoverensstemmende base i murine og svin sekvens produceret en dejlig fluorescenssignal. Et andet spørgsmål refererer til effektiv optagelse af nanopartiklerne. De partikler indcellerne ved endocytose, en proces, der er påvirket af størrelsen af nanopartiklerne 21, at celletypen og differentieringsstatus 22 og det cellulære kapacitet udføre phago- og macropinocytosis 23. Den optimale koncentration for at opnå en tilfredsstillende fluorescenssignal skal testes for hver enkelt ansøgning eller cellelinie. Med henblik herpå bør det første eksperiment altid være anvendelsen af optagelsen kontrol for at vurdere foreneligheden af sonderne inden for de celletyper og dyrkningsbetingelser før man går videre til at målrette-specifik påvisning af genekspression.
Et kritisk punkt for at opnå pålidelige resultater ved anvendelsen af denne protokol til en roman cellelinje eller cellepopulation er inddragelsen af ordentlig kontrol. Den stadigt fluorescerende optagelse kontrol vil give et hint, som koncentrationer af nanopartikler vil fremkalde en tilstrækkelig fluorescerende signal i målcellepopulationen. Fluorescensen skal vurdered næste dag som signalet vil falme med tiden 17. Samtidig kapløbet kontrol uden en modpart i den eukaryote genom anvendes på en identisk koncentration skal fremkalde en ubetydelig baggrundssignal. Som et tredje kontrol er det tilrådeligt at bruge en nanopartikel specifik for en husholdning gen (f.eks GAPDH, β-Actin). Disse nanopartikler tjener som en positiv kontrol, at den fremgangsmåde kan anvendes til at påvise specifik genekspression i den valgte målcellepopulationen. Hvis disse kontroller viser sig tilfredsstillende, man kan forvente at opnå pålidelige specifikke fluorescerende signaler ved hjælp af nanopartikler er specifikke for andre målgener. Koncentrationen af de anvendte nanopartikler kan også være kritisk, da de har vist sig at nedregulere målsekvensen 24. Denne effekt kræver imidlertid meget højere koncentrationer (5 nM) end koncentrationerne anvendt i eksperimenterne præsenteret her (400 pM). Ved denne koncentration af nanoflares påvirker ikke målgen mRNA eller proteinniveauer og koncentrationer så høje som 2 nM ikke forringer spredning af HEK293 og murine ES-celler 17. Desuden har en hel genom udtryk analysen ikke afsløre nogen væsentlige ændringer i genekspression 25. Derfor ved koncentrationer op til 1 nM de nanoflares bør ikke udvise nogen vigtige bivirkninger.
En meget lovende anvendelse af denne teknologi er det muligt at mærke en given cellepopulation, der er præget af et specifikt gen. For nylig har genspecifikke nanopartikler med succes blevet anvendt til selektivt at plette levende ventrikelmyocytter 26, subpopulationer af melanomceller 27, monocytter 28 og cerebellar cellekulturer 29. Sådanne fluorescens-mærket cellepopulationer kan sorteres og renses ved flowcytometri som levende celler. Inden for onkologi er det tænkeligt at isolere levende metastatiske tumorceller i dyremodellerbaseret på deres udtryk af CEA, mest værdifulde for søgningen af potentielle metastaser fremme gener eller target strukturer. Vi har for nylig vist, at virkelig omprogrammeres murine iPS kolonier kan identificeres in situ med NANOG-specifikke nanopartikler baseret på den detekterede fluorescensintensitet 17. Derfor kunne identificere virkelig omprogrammerede iPS kolonier udføres på højt throughput platforme, som bruger robot fluorescenspåvisning og plukke enheder til at identificere de mest lovende kolonier. Denne teknologi synes at være egnet i mange forskningsområder for at vælge specifikke cellulære subpopulationer og det synes muligt at anvende nanopartikler i høje gennemløb platforme. Afslutningsvis denne protokol udgør en ny tilgang ved hjælp af fluorescens mærkede nanopartikler, som muliggør påvisning af intracellulær genekspression direkte i levende celler. Denne teknologi kan være et værdifuldt værktøj til at rense, udvide og yderligere karakterize sjældne cellulære subpopulationer i mange forskningsområder.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |