This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
En 2006, une nouvelle approche a été décrite à reprogrammer des cellules somatiques dans un état pluripotent. Après la présélection d'un tableau de reprogrammation facteurs potentiels fibroblastes murins pourraient être convertis avec succès à ce qu'on appelle induits cellules souches pluripotentes (iPS) par transduction rétrovirale et la surexpression de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Par la suite cette technique a effectivement été reproduite en utilisant des cellules somatiques de différentes espèces de mammifères y compris les humains, les singes 2 3, 4 rats, chiens, moutons 5 6 et 7 porcs. De plus, la modification ou le remplacement des protocoles en omettant le facteur de transcription c-MYC potentiellement oncogènes ont été publiés 8, 9.
Indépendamment de la reprogrammation initiale approcher le vrai pluripotence des colonies en croissance doit être confirmée, une tâche laborieuse et chronophage. Un inconvénient majeurde la majorité de ces analyses est qu'ils ne peuvent pas être effectuées sur des cellules vivantes. Facteurs de pluripotence établis tels que OCT4, SOX2, NANOG ou REX1 représentent des facteurs de transcription situés dans le noyau et leur détection exige la fixation des cellules avant l'immunohistochimie ou la lyse des cellules pour l'analyse RT-PCR 10 -. 12 Par la suite, ces cellules sont perdues pour l'avenir expériences exigeant cultures répétées de chaque colonie.
Ainsi, une technologie à analyser sur la pluripotence des cellules vivantes est hautement souhaitable. Plusieurs approches peuvent en effet être effectuées directement sur les cellules vivantes en utilisant des anticorps dirigés contre des antigènes membranaires (par ex. TRA-1-60, SSEA4) 12, rapporté colorants fluorescents pour détecter la phosphatase 13 alcaline ou de petites molécules lesquelles une étiquette spécifique souches embryonnaires (ES) et 14 cellules iPS. Cependant, les anticorps pourraient néanmoins affecter les cellules et chaque method est limitée à un seul marqueur pluripotent. Enfin, les balises moléculaires fluorescents, des oligonucleotides antisens à double ayant des structures en épingle à cheveux, qui permettent la coloration des cellules en temps réel, ont été décrits 15. Bien que cette approche peut être appliquée à de nombreux gènes, la technique nécessite nucléofection d'une suspension cellulaire unique, qui ne sont pas applicables aux colonies iPS en croissance.
Il ya quelques années nanoparticules spécifiques du gène ont été décrits pour analyser l'expression de la survivine dans les cellules cancéreuses du sein humain SKBR3 16. Ce manuscrit décrit une approche novatrice roman à la détection de marqueurs de pluripotence dans ES vivants et des cellules iPS grâce à l'utilisation de conjugués de nanoparticules d'or. Ces nanoparticules sont constituées d'une particule d'or avec un brin central de capture couplé portant la séquence d'ARN complémentaire et un brin marqué au Cy3 reporter. Le signal fluorescent du brin rapporteur est éteinte par la particule d'or central. En outre, appropriéenanoparticules servent de témoins négatifs et positifs, respectivement (figure 1). Pour une application simplement les nanoparticules sont ajoutées au milieu de culture (figure 2) et pénètrent dans les cellules par endocytose (Figure 3). Si l'ARN cible est exprimé, il déplace le brin de journaliste qui émet alors un signal fluorescent. Cette méthode ne nécessite pas la manipulation de la cellule cible et l'expression du gène cible peut être contrôlée optiquement sous un microscope à fluorescence directement dans les cellules vivantes. En outre, la technologie peut être appliquée à n'importe quel gène cible souhaitée entre les espèces dans le cas de cellules iPS et donc peut être utilisé dans de nombreux domaines de recherche différents. Enfin, la cytométrie en flux analyse permettant l'identification et à l'enrichissement de cellules positives Cy3.
Le présent ouvrage décrit l'utilisation de nanoparticules marqué par fluorescence qui permettent l'évaluation fiable de l'expression du gène intracellulaire directement dans les cellules vivantes provenant de différentes espèces de mammifères avec de diverses origines histogénétique sous un microscope à fluorescence. Cette approche présente plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes publiées. Tout d'abord le chercheur ne se limite pas à l'égard de l'une ou l'autre gène cible ou type de cellule. Toutes les méthodes de détection des anticorps en fonction sont limités à un épitope unique. Bien que les balises moléculaires fluorescents peuvent également être conçus pour un large spectre de gènes, cette méthode nécessite la dissociation des cellules et des 15 nucléofection ultérieur. En revanche, l'application de nanoparticules spécifiques d'un gène ne nécessite aucune manipulation de la cellule cible qui engloutit les nanoparticules activement par endocytose. Au cours de repiquage ultérieur des particules d'or quittent progressivement les cellules et la culture peuvent être utilisés dans downstream expériences.
Néanmoins, la technologie a aussi encore quelques limitations. Certains marqueurs sont évidemment pas détectable en raison de leur nature glucidique comme SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actuellement, une large gamme de nanoparticules est disponible dans le commerce. Ces particules ont été pré-testés pour leur fonctionnalité dans des expériences cellulaires. L'objectif de ce travail était de concevoir des sondes personnalisées qui peuvent être utilisés à travers les espèces frontières. En suivant une telle approche ou lors de la conception d'une sonde pour un roman d'un gène cible doit être conscient que la fonctionnalité d'un in silico prédit sonde doit être soigneusement évaluée in vitro. La sonde NANOG-SF3 qui a montré une homologie de 100% à l'homologie de séquence n'a pas fonctionné du tout en NANOG-SF1 avec une base dépareillés dans le murin et la séquence porcine produit un signal de fluorescence agréable. Une autre question se réfère à l'absorption efficace des nanoparticules. Les particules entrentles cellules par endocytose, un processus qui est influencé par la taille des nanoparticules 21, le type de cellule et l'état de différenciation 22 cellulaire et la capacité d'effectuer des phagocytose et macropinocytose 23. La concentration optimale pour obtenir un signal de fluorescence satisfaisant doit être testé pour chaque application individuelle ou lignée cellulaire. À cette fin, la première expérience devrait toujours être l'application de la commande de capture pour évaluer la compatibilité des sondes dans les types cellulaires et conditions de culture avant de passer au-cible spécifique détection de l'expression du gène.
Un point essentiel pour obtenir des résultats fiables lors de l'application de ce protocole à une ligne nouvelle cellule ou population de cellules est l'inclusion de contrôles appropriés. Le contrôle de l'absorption jamais fluorescent fournira une indication des concentrations de nanoparticules qui induiront un signal de fluorescence suffisante de la population de cellules cibles. La fluorescence doit être évaluerd le lendemain que le signal se fanent avec le temps 17. Dans le même temps le contrôle de brouillage sans un homologue dans le génome eucaryote appliqué à une concentration identique doit induire un signal de fond négligeable. Comme un troisième contrôle, il est conseillé d'utiliser une nanoparticule spécifique d'un gène de ménage (par exemple GAPDH, β-actine). Ces nanoparticules servent de témoin positif que l'approche peut être utilisée pour détecter l'expression spécifique du gène dans la population de cellules cible sélectionné. Si ces contrôles révèlent un satisfaisant peut attendre à obtenir des signaux fluorescents spécifiques fiables utilisant des nanoparticules spécifiques pour d'autres gènes cibles. La concentration des nanoparticules peut également être appliqués critique car ils se sont révélés réguler à la baisse la séquence cible 24. Cependant, cet effet requiert concentrations beaucoup plus élevées (5 nm) que les concentrations utilisées dans les expériences présentées ici (400 heures). A cette concentration, le nanoflares ne touchent pas l'ARNm du gène cible ou les niveaux et les concentrations aussi élevées que 2 nM ne nuisent pas à la prolifération des cellules HEK293 et ES murines 17 protéines. En outre, toute une analyse de l'expression du génome n'a pas révélé de changements significatifs dans l'expression du gène 25. Par conséquent, à des concentrations allant jusqu'à 1 nM les nanoflares ne devraient pas présenter des effets indésirables importants.
Une application très prometteuse de cette technologie est la possibilité de marquer une population cellulaire donnée qui est marquée par un gène spécifique. Récemment, des nanoparticules spécifiques de gènes ont été utilisés avec succès pour colorer sélectivement les myocytes ventriculaires en direct 26, sous-populations de 27 cellules de mélanome, des monocytes et des cellules du cervelet 28 29 cultures. De telles populations de cellules marquées par fluorescence peuvent être triés et purifiés par cytométrie en flux des cellules comme vivantes. Dans le domaine de l'oncologie, il est imaginable pour isoler les cellules tumorales métastatiques en direct dans des modèles animauxen fonction de leur expression de CEA, le plus précieux pour la recherche de métastases potentiel promotion des gènes ou des structures cibles. Nous avons récemment montré que les colonies iPS vraiment reprogrammées murins peuvent être identifiées in situ avec Nanog spécifique de nanoparticules à base de l'intensité de fluorescence détectée 17. Par conséquent, l'identification des colonies iPS vraiment reprogrammées peut être effectuée sur des plates-formes à haut débit, qui utilisent la détection de fluorescence et des dispositifs de prélèvement de robot afin d'identifier les colonies les plus prometteurs. Cette technologie semble être approprié dans de nombreux domaines de recherche pour sélectionner les sous-populations cellulaires spécifiques et il semble possible d'appliquer les nanoparticules dans les plates-formes à haut débit. En conclusion, ce protocole représente une nouvelle approche utilisant marqué par fluorescence des nanoparticules qui permet la détection de l'expression génique intracellulaire directement dans les cellules vivantes. Cette technologie peut être un outil précieux pour purifier, développez et davantage de caractèreiser sous-populations cellulaires rares dans de nombreux domaines de recherche.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |