This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
2006年には、新たなアプローチは、多能性の状態に体細胞を再プログラムすることが記載されました。潜在的な再プログラミングの配列のプレスクリーニングした後、マウスの線維芽細胞が正常に人工多能性幹細胞(IPS)、レトロウイルス形質導入および4転写因子の過剰発現による、いわゆるに変換する可能性のある要因( のOct4、Sox2の、Klf4の、C-Mycの )1。その後、この技術は、効果的に人間2、サル3、ラット4、犬5、羊6、豚7を含む別の哺乳動物種の体細胞を用いて再現されています。また、C-MYC、潜在的に発癌性転写因子を省略または交換プロトコルが変更された8,9を公開されています。
かかわらず、最初の再プログラミングの、増殖するコロニーの真の多能性を確認する必要があり、面倒で時間のかかる作業に近づきます。主な欠点これらの分析の大部分、それらが生細胞で行うことができないということです。確立されたそのようなOCT4、SOX2、NANOGまたはREX1等の多能性因子は核内に位置する転写因子を表し、それらの検出は、従来のRT-PCR分析10のための免疫組織化学または細胞溶解への細胞の固定必要– 12をその後、これらの細胞は将来のために失われます各コロニーの複製培養を必要とする実験。
したがって、生細胞に多能性を分析するための技術は、非常に望ましいです。 12いくつかのアプローチが実際に膜ベースの抗原に対する抗体を使用して、生細胞上で直接実行することができる( 例えば 。TRA-1-60、SSEA4)、蛍光は、アルカリホスファターゼに特異的胚性幹(ES)の標識13または小分子を検出するための染料を報告しましたそして、iPS細胞14を 。しかし、抗体は、それにもかかわらず、不利な細胞や各メタに影響を与える可能性がありますODは、単一の多能性マーカーに制限されています。最後に、蛍光分子ビーコンは、細胞の生の染色を可能にするヘアピン構造、デュアルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、15に記載されています。このアプローチは、多くの遺伝子に適用することができるが、この技術は、成長のiPSコロニーに適用されない単一細胞懸濁液のヌクレオを必要とします。
数年前に、遺伝子特異的なナノ粒子は、ヒトSKBR3乳癌細胞16内サバイビンの発現を分析するために記載されています。この原稿は、金ナノ粒子複合体の使用を使用して、ライブESおよびiPS細胞における多能性マーカーを検出するための新規の革新的なアプローチを説明します。これらのナノ粒子は、相補的なRNA配列を有する結合された捕獲鎖との中央の金粒子とCy3標識レポーター鎖で構成されています。レポーター鎖の蛍光シグナルは、中央金粒子によりクエンチします。また、適切なナノ粒子は、( 図1)は、それぞれ、負および正の対照として役立ちます。 ( 図3)を適用するためのナノ粒子は、単に培地( 図2)に添加し、エンドサイトーシスを介して細胞に入ります。標的RNAが発現されている場合には、その後、蛍光シグナルを発するレポーター鎖を置換します。この方法は、標的細胞の操作を必要とせず、標的遺伝子の発現は、生細胞内で直接蛍光顕微鏡下で光学的にモニターすることができます。さらに、この技術はiPS細胞の場合には種を超えて任意の所望の標的遺伝子に適用することができ、多くの異なる研究分野で用いられてもよいです。最後に、フローサイトメトリーは、Cy3の陽性細胞の同定および濃縮を可能に分析します。
本研究は、蛍光顕微鏡下で、多様なhistogenetic起源と異なる哺乳動物種からの生細胞に直接細胞内の遺伝子発現の信頼性の評価を可能蛍光ラベルされたナノ粒子の使用を記載しています。このアプローチは、他の公表された方法に比べて利点がいくつかあります。まず研究の標的遺伝子または細胞型のいずれかに関して限定されるものではありません。すべての抗体ベースの検出方法は、単一のエピトープに制限されています。蛍光分子ビーコンはまた、遺伝子の広いスペクトルのために設計することができるが、この方法は、細胞とそれに続くヌクレオ15の解離を必要とします。対照的に、遺伝子特異的なナノ粒子の適用は、エンドサイトーシスによって積極的にナノ粒子を飲み込む標的細胞のいずれかの操作を必要としません。その後の継代の間、金粒子は徐々に細胞を残し、文化がdownstreaに使用することができますM実験。
それにもかかわらず、技術もまだいくつかの制限があります。いくつかのマーカーは、そのようなSSEA-1、TRA-1-81 20としての炭水化物の性質は明らかに検出されません。現在では、ナノ粒子の大規模な配列は、市販されています。これらの粒子は、細胞の実験ではその機能のためにあらかじめテストされています。本研究の目的は、種の国境を越えて使用することができるカスタマイズされたプローブを設計することでした。新規標的遺伝子いずれかのプローブを設計する際に、このようなアプローチを以下の場合、またはin silicoでの機能は、プローブが完全にin vitroで評価する必要があると予測することを認識することがあります。 NANOG-SF1は1マウスにおけるミスマッチ塩基およびブタ配列に素敵な蛍光シグナルを生成しながら、配列相同性に100%の相同性を示したNANOG-SF3プローブは全く動作しませんでした。もう一つの問題は、ナノ粒子の効率的な取り込みを指します。粒子が入りますエンドサイトーシス、ナノ粒子21の大きさに影響されるプロセスによる細胞は、細胞型及び分化状態22と細胞が食細胞の機能を実行し、23のマクロピノします。満足な蛍光シグナルを得るための最適濃度は、個々のアプリケーションまたは細胞株について試験されなければなりません。そのために、最初の実験は、常に、標的特異する遺伝子発現の検出に移動する前に、細胞タイプおよび培養条件内プローブの適合性を評価するために、取り込み制御を適用すべきです。
新規な細胞株または細胞集団に、このプロトコルを適用した場合、信頼できる結果を得るための重要な点は、適切なコントロールを含めることです。これまで蛍光取り込み制御は、ナノ粒子の濃度は、標的細胞集団に十分な蛍光シグナルを誘導するヒントを提供します。蛍光が評価されなければなりませんD信号として、次の日は、時間17でフェードインします。同時に、同一の濃度で適用真核生物のゲノム中の対応のないスクランブル制御は無視できるバックグラウンドシグナルを誘導しなければなりません。第三の制御としては、ハウスキーピング遺伝子(例えば、GAPDH、βアクチン )のための特定のナノ粒子を使用することをお勧めします。これらのナノ粒子は、方法は、選択された標的細胞集団に特異的な遺伝子発現を検出することができる陽性対照として役立ちます。これらのコントロールが判明した場合、良好一つは他のターゲット遺伝子に特異的ナノ粒子を使用して、信頼性の高い特定の蛍光シグナルを得ることを期待することができます。それらが標的配列24をダウンレギュレートすることが示されているように適用されるナノ粒子の濃度はまた、重要であり得ます。しかし、この効果は、ここ(400 PM)に提示した実験で使用される濃度よりもはるかに高い濃度(5 nM)を必要とします。この濃度でnanoflaRESは、標的遺伝子mRNAまたはタンパク質レベルおよびHEK293およびマウスES細胞17の増殖を阻害しない2 nmと高濃度に影響を与えません。また、全ゲノム発現解析は、遺伝子発現の25の有意な変化を示さありませんでした。したがって、1 nMのまでの濃度でnanoflaresは重要な悪影響を示してはなりません。
この技術の非常に有望なアプリケーションは、特定の遺伝子によってマークされている任意の細胞集団を標識するための可能性です。近年、遺伝子特異的ナノ粒子が首尾よく選択ライブ心室筋26、黒色腫細胞27、単球28および小脳細胞培養物29の亜集団を染色するために使用されています。このような蛍光標識された細胞集団を生細胞として、フローサイトメトリーによってソートし、精製することができます。腫瘍学の分野では、動物モデルにおいて転移性腫瘍生細胞を単離することが想像され潜在的な転移促進遺伝子または標的構 造の探索のための最も貴重な、CEAの発現に基づいて。我々は最近、真に再プログラムマウスのiPSコロニーが検出された蛍光強度に基づいて、17 のNanog特異的ナノ粒子とその場で識別することができることを示しています。したがって、真に再プログラミングのiPSコロニーの同定は、最も有望なコロニーを同定するためにロボットの蛍光検出とピッキング装置を使用するハイスループットプラットフォーム上で実行することができます。この技術は、特定の細胞亜集団を選択するために多くの研究分野で適切であると思われ、それはハイスループットプラットフォームにナノ粒子を適用することが可能と思われます。結論として、このプロトコルは、生細胞内で直接細胞内の遺伝子発現の検出を可能にする蛍光標識されたナノ粒子を用いた新規アプローチを表します。この技術は、浄化拡大し、さらに文字に貴重なツールとすることができます多くの研究分野では珍しい携帯亜集団をIZE。
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |