This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
2006 yılında, yeni bir yaklaşım pluripotent haline somatik hücre yeniden programlamak için tarif edilmiştir. Potansiyel yeniden programlama bir dizinin prescreening sonra murin fibroblast başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücreler (IPS) Retroviral transdüksiyonun dört transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile sözde dönüştürülmüş olabilir faktörleri (Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc) 1. Daha sonra, bu teknik, etkili bir şekilde, insanlarda 2, maymunlar 3, sıçan 4, köpeklerde 5, koyun ve domuz 6 7 de dahil olmak üzere, farklı memeli türlerinin somatik hücreler kullanılarak yeniden. Buna ek olarak, protokoller atlayarak ya MYC 8, 9 yayınlanmış c- potansiyel onkojenik transkripsiyon faktörünü yerine güncellenmiştir.
Ne olursa olsun, ilk yeniden programlama büyüyen kolonilerin gerçek pluripotency, zahmetli ve zaman alıcı bir görev onaylanmalıdır yaklaşım. Önemli bir dezavantajıBu analizlerin büyük bir çoğunluğunun canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilemez olmasıdır. Örneğin Oct4, Sox2 NANOG ya Rex1 olarak kurulan pluripotense faktörleri çekirdeğinde bulunan transkripsiyon faktörlerini temsil eder ve algılama RT-PCR analizi için 10 immünohistokimya veya hücre parçalama öncesinde hücrelerin tespit gerektirir -. 12 Bundan sonra, bu hücreler, gelecekte kaybolur Her koloninin çoğaltmak kültürleri gerektiren deneyler.
Bu nedenle, canlı hücreler üzerinde pluripotensini analiz etmek için bir teknoloji arzu edilmektedir. Çeşitli yaklaşımlar gerçekten de membran bazlı antijenlere karşı antikorlar kullanılarak canlı hücreler üzerinde doğrudan ifa edilebilir (örn., TRA-1-60, SSEA4) 12, floresan özellikle embriyonik kök etiket alkalin fosfataz 13 ya da küçük moleküllerin tespit boyalar bildirilmiştir (ES) ve iPS hücreleri 14. Ancak, antikorlar yine olumsuz hücreleri ve her meth etkileyebilirod tek pluripotense işaretleyici ile sınırlıdır. Son olarak, floresan molekül işaretleri, hücrelerin canlı boyama sağlar hairpin yapılar, çift-antisens oligonükleotidler, 15 tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, çok sayıda genin tatbik edilebilir olmasına rağmen, teknik, artan iPS koloniler için geçerli değildir, tek bir hücre süspansiyonu, nucleofection gerektirir.
Bir kaç yıl önce gen spesifik nanoparçacıklarının SKBR3 meme kanseri hücreleri 16 survivin ekspresyonunu analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu el yazması altın nanoparçacık konjugatlarında kullanımı yoluyla canlı ES ve iPS hücreleri pluripotency işaretçileri tespit için yeni bir yenilikçi bir yaklaşım anlatılmaktadır. Bu nanopartiküller tamamlayıcı RNA dizisi ve bir Cy3 etiketli muhabiri teli taşıyan bir birleştiğinde yakalama sarmalı ile merkezi altın parçacık oluşur. Raportör telinin flüoresan sinyal merkez altın parçacığı ile söndürülür. Buna ek olarak, uygun birnanopartiküller olarak negatif ve pozitif kontroller, sırasıyla (Şekil 1) hizmet vermektedir. (Şekil 3) bir uygulama için, nanopartiküller, sadece kültür ortamı (Şekil 2) ilave edilir ve endositoz vasıtasıyla hücrelere girmek. Hedef RNA ifade edilirse o zaman bir floresan sinyal yayan muhabiri strand değiştirir. Bu yöntem, hedef hücre, hedef genin ifade manipülasyon canlı hücreler direkt olarak bir floresan mikroskobu altında optik olarak izlenebilir gerektirmez. Bundan başka, teknik iPS hücrelerinin durumunda türler arasında arzu edilen herhangi bir hedef gene uygulanabilir ve böylece birçok farklı alanlarda, kullanılabilir. Son olarak, akım sitometri Cy3 pozitif hücrelerin belirlenmesi ve zenginleştirme izin analizleri.
Bu çalışma, doğrudan bir floresan mikroskobu altında çeşitli histogenetik kökenli farklı memeli türünden canlı hücrelerde hücre içi gen ekspresyonunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlar floresans etiketli nanopartiküller kullanımını tarif eder. Bu yaklaşım, diğer yayınlanmış yöntemlere kıyasla avantajları bir çift vardır. Tüm araştırmacı ilk hedef gen ya da hücre tipi, ya ayn sınırlı değildir. Tüm antikor bazlı algılama yöntemleri, tek bir epitop ile sınırlıdır. Floresan moleküler işaretçileri de genlerin geniş spektrumunun için tasarlanmış olsa da, bu yöntem, hücrelerin ve daha sonra nucleofection 15 ayrılmasını gerektirir. Bunun aksine, gene özgü nanoparçacıkların uygulaması etkin endositoz ile nano-tanecikleri engulfs hedef hücrenin herhangi bir şekilde değiştirilmesine gerek yoktur. Daha sonra Pasajlanması sırasında altın parçacıkları yavaş yavaş hücreleri ayrılıp kültür downstrea kullanılabilirm deneyleri.
Bununla birlikte, teknoloji de hala bazı sınırlamalar vardır. Bazı belirteçler sayesinde böyle SSEA-1 veya TRA-1-81 20 olarak karbonhidrat doğaya açıkça tespit edilebilir değildir. Şu anda, nanopartiküllerin büyük bir dizi ticari olarak temin edilebilir. Bu parçacıklar, hücresel deneylerde işlevleri açısından test edilmiş olan. Mevcut çalışmanın amacı türlerinin sınırların ötesine kullanılabilecek özel problar tasarım oldu. Yeni bir hedef gen biri için bir prob tasarlarken böyle bir yaklaşımı takip ya da ne zaman silico bir işlevselliği probu iyice in vitro değerlendirilmesi gereken tahmin farkında olmak zorundadır. Nanog-SF1 tek sıçangil eşleşmeyen tabanı ve domuz dizisi ile güzel bir floresan sinyal üretti ise dizi homoloji% 100 homoloji göstermiştir Nanog-SF3 sonda hiç işe yaramadı. Başka bir soru nanopartiküller verimli alımı anlamına gelir. Parçacıklar girmekendositoz nanopartiküller 21 büyüklüğüne etkilenir bir proses ile hücrelerin, hücre tipi ve farklılaşma durumu 22 ve hücresel kabiliyeti phago- gerçekleştirmek ve 23 makropinositoz etmek. Tatmin edici bir floresan sinyalini elde etmek üzere optimum konsantrasyonu, her bir uygulama ya da bir hücre hattı için test edilmesi gerekir. Bu amaçla, ilk deney, her zaman hedef spesifik gen ifade algılama geçmeden önce hücre tipleri ve kültür koşulları içindeki sondaların uyumluluğunu değerlendirmek için alım kontrolü uygulama olmalıdır.
Yeni bir hücre kuşağına bu protokolü uygulanır veya hücre popülasyonunun uygun kontroller dahil olduğunda, kritik bir nokta güvenilir sonuçlar elde edilmiştir. Şimdiye kadar floresanlama alım kontrolü nanopartiküller konsantrasyonları, hedef hücre popülasyonunun yeterli bir floresan sinyali uyardığı bir ipucu sağlayacaktır. Floresan değerlendirilmesi gerekird sinyali olarak ertesi gün süre ile 17 kaybolacak. Aynı zamanda, aynı konsantrasyonda uygulanmıştır ökaryotik genomunda benzeri yok karıştırmak kontrol ihmal edilebilir bir arka plan sinyalini neden olmalıdır. Üçüncü bir kontrol olarak, bir bir ev bakıcısı geni için spesifik nanoparçacık (örneğin, GAPDH, β-aktin) kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu yaklaşım, nanopartiküller seçilen bir hedef hücre popülasyonuna spesifik gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilecek bir pozitif kontrol olarak hizmet etmektedir. Bu kontroller açarsanız tatmin edici bir başka hedef genlerin özel nanopartiküller kullanılarak güvenilir özgü flüoresan sinyalleri elde etmek için bekleyebilirsiniz. Bu hedef sekans 24 aşağı regüle ettiği gösterilmiştir olarak tatbik nano-taneciklerinin konsantrasyonu kritik olabilir. Bununla birlikte bu etki burada (400 pM) sunulan deneylerde kullanılan konsantrasyonlarda çok daha yüksek konsantrasyonlarda (5 nM) gerektirir. Bu konsantrasyonda nanofla Atres hedef genin mRNA ya da protein seviyelerinin ve HEK293 ve sıçangil ES hücreleri 17 proliferasyonunu bozmaması 2 nM kadar yüksek konsantrasyonlarda etkilemez. Buna ek olarak, bir tüm genom ekspresyon analizi, gen ekspresyonu 25 herhangi bir önemli değişiklik göstermemiştir. Bu nedenle, 1 nM kadar olan konsantrasyonlarda nanoflares hiçbir önemli yan etkiler sergileyen olmamalıdır.
Bu teknolojinin bir çok umut verici bir uygulama, belirli bir gen ile işaretlenmiş herhangi bir belirli hücre popülasyonu etiket olasılığıdır. Son zamanlarda, gen spesifik nanopartiküller başarılı seçici canlı ventriküler miyositleri 26, melanom hücrelerinin 27 subpopülasyonunun leke kullanılmıştır, 28 ve serebellar hücre kültürlerinin 29 monositler. Bu floresan işaretli hücre popülasyonları kriteri gibi canlı hücreler, akış sitometrisi ile saflaştırılabilir. Onkoloji alanında, hayvan modellerinde canlı metastatik tümör hücreleri izole etmek için akla gelebilecek olanCEA kendi ifadesi, genleri veya hedef yapıları teşvik potansiyel metastaz arama için en değerli dayalı. Son zamanlarda, gerçekten yeniden programlanması sıçangil iPS koloniler tespit floresan yoğunluğu 17 göre Nanog-spesifik nanopartiküller ile yerinde tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, gerçekten yeniden programlanması iPS kolonilerin tanımlanması en umut verici koloniler belirlemek için robot floresens toplama cihazları kullanmak yüksek kapasiteli platformlarda yapılabilir. Bu teknoloji spesifik hücresel alt popülasyonlar seçmek için birçok araştırma alanlarında uygun gibi görünmektedir ve yüksek kapasiteli platformlarda nanopartiküller uygulamak mümkün görünmektedir. Sonuç olarak, bu protokol, canlı hücreler, doğrudan hücre içi gen ifadesinin algılanmasını sağlar floresans etiketli nano-tanecikleri kullanılarak yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bu teknoloji, bir, arındırmak genişletmek için değerli bir araç ve daha fazla karakter olabilirBirçok araştırma alanlarında nadir hücresel subpopülasyonunun ize.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |