Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes
Summary
We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.
Abstract
Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.
Introduction
Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu'ils sont venus dans l'usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D 1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d'imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides 6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde 7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l'ellipsoïde 12. Il a été émis l'hypothèse que l'hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement 13,14. Par conséquent, la capacité d'analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales.
Le système d'indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d'ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange – KO) et vert (Azami Vert – AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire 15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l'aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l'utilisation d'un logiciel d'imagerie ou d'un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Semi-automatisé d'analyse d'image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d'un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d'identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l'expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).
Materials
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 um | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 mL tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 mL tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
Referências
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