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Biologia

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

Identificare gli obiettivi diretti di molecole-genoma di mira resta una sfida importante. Per capire come le molecole che legano il DNA impegnano il genoma, abbiamo sviluppato un metodo che si basa sulla reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC).

Abstract

Il genoma è il bersaglio di alcuni dei chemioterapici più efficaci, ma la maggior parte di questi farmaci mancano DNA specificità di sequenza, che porta a dose-limitante tossicità e molti effetti collaterali negativi. Targeting il genoma con piccole molecole sequenza-specifiche può consentire molecole con maggiore indice terapeutico e minori effetti fuori bersaglio. N -methylpyrrole / N poliammidi -methylimidazole sono molecole che possono essere razionalmente progettati per indirizzare specifiche sequenze di DNA con squisita precisione. E a differenza di molti fattori di trascrizione naturali, poliammidi possono legarsi al DNA metilato e chromatinized senza perdita di affinità. La specificità sequenza di poliammidi è stata ampiamente studiata in vitro con l'identificazione del sito cognate (CSI) e con approcci tradizionali biochimici e biofisici, ma lo studio di poliammide vincolanti agli obiettivi genomici nelle celle rimane inafferrabile. Qui riportiamo un metodo, la reticolazione di piccole molecole per Isolate cromatina (COSMIC), che identifica i siti di legame di poliammide in tutto il genoma. COSMIC è simile a immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), ma differisce in due modi importanti: (1) un photocrosslinker viene impiegato per consentire selettiva, cattura temporalmente controllata di poliammide eventi di legame, e (2) la maniglia affinità biotina è usato per purificare poliammide coniugati -DNA in condizioni di semi-denaturazione per diminuire DNA che non è legato covalentemente. COSMIC è una strategia generale che può essere utilizzato per rivelare gli eventi di legame genoma di poliammidi e di altri agenti chemioterapici genome-targeting.

Introduction

Le informazioni da rendere ogni cellula del corpo umano è codificato nel DNA. L'uso selettivo di tali informazioni governa il destino di una cellula. I fattori di trascrizione (TFS) sono proteine ​​che si legano a specifiche sequenze di DNA di esprimere un particolare sottoinsieme dei geni nel genoma, e il malfunzionamento del TF è legata alla comparsa di una vasta gamma di malattie, tra cui difetti di sviluppo, il cancro e il diabete . 1,2 Siamo stati interessati a sviluppare molecole in grado di legare selettivamente al genoma e modulare reti di regolazione genica.

Poliammidi composto da N e N -methylimidazole -methylpyrrole sono molecole in grado di indirizzare il DNA con specificità e affinità che rivali fattori di trascrizione naturali. 3-6 Queste molecole si legano a sequenze specifiche nella solco minore del DNA razionalmente progettati. 4,5,7 -11 Poliammidi sono stati impiegati sia repress e attivare l'espressione di specifici gEnes. 4,12-19 Essi hanno anche interessanti antivirali e antitumorali 20-24 12,13,25-30 proprietà. Una caratteristica interessante di poliammidi è la loro capacità di accedere a sequenze di DNA che sono metilati 31,32 e avvolti intorno proteine ​​istoniche 9,10,33.

Per misurare le specificità completi vincolanti di molecole che legano il DNA, il nostro laboratorio ha creato il metodo di identificatore del sito affine (CSI). 34-39 La presenza prevista di siti di legame sulla base di specificità in vitro (genomescapes) possono essere visualizzati sul genoma, perché la in vitro intensità vincolanti sono direttamente proporzionali alla costanti di associazione (K a). 34,35,37 Queste genomescapes permettono di percepire occupazione poliammide in tutto il genoma, ma misurare poliammide legame in cellule vive è stata una sfida. DNA è strettamente impaccato nel nucleo, che potrebbe influenzare l'accessibilità dei siti di legame. L'accessibility di queste sequenze di DNA chromatinized a poliammidi rimane un mistero.

Recentemente, molti metodi per studiare le interazioni tra piccole molecole e acidi nucleici sono emersi. 40-48 La cattura affinità chimica e sequenziamento del DNA massicciamente paralleli (chem-SEQ) è una tale tecnica. Chem-ss utilizza formaldeide per reticolare piccole molecole ad un target genomica di interesse e di un derivato biotinilato di una piccola molecola di interesse per catturare l'interazione ligando-bersaglio. 48,49

Formaldeide reticolazione porta a interazioni indirette che possono produrre dei falsi positivi. 50 Abbiamo sviluppato un nuovo metodo, la reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC), 51 con un photocrosslinker per eliminare questi cosiddetti picchi "fantasma". 50 Per iniziare, abbiamo progettato e sintetizzato derivati ​​trifunzionali di poliammidi. Queste molecole contenevano una pol-legame al DNAyamide, un photocrosslinker (psoralen), e una maniglia di affinità (biotina, Figura 1). Con poliammidi trifunzionali, possiamo covalente di catturare le interazioni in poliammide-DNA con irradiazione UV 365 nm, una lunghezza d'onda che non danneggia il DNA o indurre non psoraleni a base di reticolazione. 51 Successivamente, frammentare il genoma e purificare il DNA catturato sotto severe, semi condizioni -denaturing per diminuire DNA che non è legato covalentemente. Quindi noi consideriamo COSMIC come metodo correlate a chem-seq, ma con una lettura più diretta di DNA targeting. È importante sottolineare che i deboli (K 10 3 -10 4 M -1) affinità di psoraleni per il DNA non rilevabile poliammide impatto specificità. 51,52 I frammenti di DNA arricchito possono essere analizzati da una delle polimerasi quantitativa reazione a catena 51 (COSMIC-qPCR) o per sequenziamento di prossima generazione 53 (COSMIC-ss). Questi dati consentono un design imparziale genoma-guidata di ligandi che l'Interagire con loro loci genomici desiderato e minimizzare gli effetti fuori bersaglio.

Figura 1
Figura 1. poliammidi bioattivi e schema cosmico. (A) Hairpin poliammidi 1-2 bersaglio la sequenza del DNA 5'-WACGTW-3 '. Poliammidi lineari 3-4 bersaglio 5'-AAGAAGAAG-3 '. Anelli di N-metilimidazolo sono in grassetto per chiarezza. Cerchi aperti e pieni rappresentano N -methylpyrrole e N -methylimidazole rispettivamente. Square rappresenta 3 clorotiofene, e diamanti rappresentano β-alanina. Psoraleni e biotina sono indicati con P e B, rispettivamente. (B) schema cosmico. Le cellule vengono trattate con derivati ​​trifunzionali di poliammidi. Dopo la reticolazione con irradiazione UV 365 nm, le cellule sono lDNA genomico ysed e viene tagliata. Sfere magnetiche rivestite di streptavidina vengono aggiunti per catturare addotti poliammide-DNA. Il DNA viene rilasciato e può essere analizzato mediante PCR quantitativa (qPCR) o sequenziamento di prossima generazione (NGS). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. La reticolazione in cellule vive Inizia con ~ 2.5×10 7 celle H1, o altre cellule in coltura. NOTA: Il numero di celle H1 corrisponde a cinque piatti da 10 cm (circa il 40% di confluenza). Crescere cellule in E8 media su piatti ricoperti su una superficie in grado di supportare le cellule staminali pluripotenti (vedi Materiali List), e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2. Celle di raccolta enzimatica (vedi Materiali List). Nota: Non lasciare le ce…

Representative Results

Per tenere conto di non uniforme genoma frammentazione e altre variabili, il DNA purificato deve sempre essere normalizzato contro un riferimento di DNA Input. Primer specifici di un luogo di interesse possono essere utilizzati. È utile analizzare anche un locus qualora non si preveda la molecola di legare, come controllo negativo. Vediamo un aumento> 100 volte in occupazione poliammide upon irraggiamento con luce di 365 nm (Figura 2). Arricchito DNA può essere analizza…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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