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Biologia

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

Die Ermittlung der direkten Ziele der Genom-Targeting-Moleküle vor eine große Herausforderung. Zu verstehen, wie DNA-bindende Moleküle greifen das Erbgut, eine Methode, die auf die Vernetzung von kleinen Molekülen beruht, um Chromatin zu isolieren (COSMIC) entwickelten wir.

Abstract

Das Genom ist das Ziel von einigen der wirksamsten Chemotherapeutika, aber die meisten dieser Medikamente fehlt DNA-Sequenzspezifität, die dosislimitierende Toxizität und viele unerwünschte Nebenwirkungen führt. Targeting des Genoms mit sequenzspezifischen kleine Moleküle können Moleküle mit einem erhöhten therapeutischen Index und weniger Nebeneffekte zu ermöglichen. N -methylpyrrole / N-Methylimidazol Polyamide sind Moleküle, die rational gestaltet werden kann, um spezifische DNA-Sequenzen mit vorzüglicher Präzision abzuzielen. Und im Gegensatz zu den meisten natürlichen Transkriptionsfaktoren, Polyamide können methylierte und chromatinized DNA ohne einen Verlust der Affinität binden. Die Sequenzspezifität der Polyamide wurde ausgiebig in vitro mit zugehörigen Standort-Identifizierung (CSI), die mit traditionellem biochemische und biophysikalische Methoden untersucht, aber die Untersuchung der Bindung an Polyamid genomische Ziele in Zellen weiter Ferne. Eine Methode Wir berichten hier, um die Vernetzung von kleinen Molekülen isolate Chromatin (COSMIC), dass identifiziert Polyamid-Bindungsstellen in das Genom. KOSMISCHER ähnelt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), unterscheidet sich jedoch in zwei wichtigen Punkten: (1) ein Photovernetzungsmittel verwendet wird, um selektiv, zeitlich gesteuerte Abscheidung von Polyamid Bindungsereignisse, und (2) das Biotin-Affinität Griff verwendet wird, um Polyamid reinigen Freigabe -DNA-Konjugate unter semi-denaturierenden Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. COSMIC ist eine allgemeine Strategie, die verwendet werden können, um die genomweite Bindungsereignisse von Polyamiden und anderen Genom-Targeting-Chemotherapeutika zu offenbaren.

Introduction

Die Informationen, um jede Zelle im menschlichen Körper in DNA kodiert. Die selektive Verwendung dieser Informationen regelt das Schicksal einer Zelle. Transkriptionsfaktoren (TF) sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden, um eine bestimmte Untergruppe der Gene im Genom zu exprimieren, und die Fehlfunktion des TFs ist mit dem Auftreten von einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsdefekten, Krebs und Diabetes . 1,2 Wir sind daran interessiert, Moleküle, die wahlweise mit dem Genom binden und modulieren Genregulationsnetzwerken können.

Polyamide N -methylpyrrole komponiert und N-Methylimidazol rational entworfene Moleküle, die DNA mit Spezifitäten und Affinitäten, die rivalisierenden natürlichen Transkriptionsfaktoren. 3-6 Diese Moleküle auf bestimmte Sequenzen in der kleinen Furche der DNA binden zielen können. 4,5,7 -11 Polyamide haben sowohl repress beschäftigt und die Expression spezifischer g aktivierenenen. 4,12-19 Sie haben auch interessante antivirale 20-24 und Anti-Krebs-12,13,25-30 Eigenschaften. Ein attraktives Merkmal der Polyamide ist ihre Fähigkeit, DNA-Sequenzen, die methyliert 31,32 sind und um Histon-Proteine ​​gewickelt 9,10,33 zuzugreifen.

Um die umfassende Bindungsspezifitäten von DNA-bindenden Moleküle zu messen, erstellt unser Labor die verwandten Standortkennung (CSI) Methode. 34-39 Die vorhergesagte Auftreten von Bindungsstellen auf Basis von in-vitro-Spezifitäten (genomescapes) können auf dem Genom angezeigt werden, weil der In-vitro-Bindungsintensität direkt proportional zur Assoziationskonstanten sind (K a). 34,35,37 Diese genomescapes Einblick in Polyamid Belegung über das Genom aber Messpolyamidbindung in lebenden Zellen eine Herausforderung gewesen. DNA wird fest in den Zellkern, die die Zugänglichkeit der Bindungsstellen beeinflussen könnten verpackt. Das accessibility dieser chromatinized DNA-Sequenzen zu Polyamiden, bleibt ein Rätsel.

In jüngster Zeit viele Methoden, um Interaktionen zwischen kleinen Molekülen und Nukleinsäuren entstanden studieren. 40-48 Die chemische Affinitätseinfangen massiv-parallelen DNA-Sequenzierung (Chem-seq) ist eine solche Technik. Chem-seq verwendet Formaldehyd, kleine Moleküle zu einer genomischen Ziel von Interesse und eines biotinylierten Derivats von einem kleinen Molekül von Interesse zu vernetzen, um den Liganden-Target-Wechselwirkung aufzunehmen. 48,49

Formaldehyd-Vernetzung führt zu einer indirekten Wechselwirkungen, Fehlalarme zu erzeugen können. 50 Wir entwickelten eine neue Methode, die Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin (COSMIC), 51 mit einem Photovernetzungsmittel zu isolieren, um diese so genannte "Phantom" Spitzen zu beseitigen. 50 zu beginnen, wir entworfen und synthetisiert trifunktionellen Derivate von Polyamiden. Diese Moleküle enthalten eine DNA-Bindungs ​​polyamide ein Photovernetzer (Psoralen) und eine Affinität Griff (Biotin, Abbildung 1). Mit trifunktionalen Polyamide, können wir kovalent erfassen Polyamid-DNA Wechselwirkungen mit 365 nm UV-Bestrahlung, einer Wellenlänge, die nicht DNA schädigt oder zu veranlassen nicht Psoralen-basierte Vernetzung. 51 Als nächstes wir Fragment des Genoms und zur Reinigung des aufgenommenen DNA unter stringenten, halb -denaturing Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. So sehen wir COSMIC als Methode zur chem-seq verwandt, aber mit einer mehr direkte Auslesen der DNA-Targeting. Wichtig ist, dass die schwache (K a 10 3 bis 10 4 M -1) Affinität von Psoralen für die DNA nicht nachweisbar Auswirkungen Polyamid-Spezifität. 51,52 Die angereicherten DNA-Fragmente kann entweder quantitative Polymerase-Kettenreaktion 51 analysiert werden (COSMIC-qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequenzierung 53 (COSMIC-seq). Diese Daten ermöglichen eine unvoreingenommene, Genom-geführte Design von Liganden interwirken mit ihren gewünschten genomischen Loci und minimieren Nebeneffekte.

Abbildung 1
Abbildung 1. Bioactive Polyamide und COSMIC Schema. (A) Hairpin Polyamiden 1-2 Target die DNA-Sequenz 5'-WACGTW-3 '. Linearen Polyamiden 3-4 Ziel 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringe der N-Methylimidazol zur Klarheit fett. Offene und gefüllte Kreise stellen N -methylpyrrole und N-Methylimidazol auf. Platz für 3-Chlorthiophen und Rauten stellen β-Alanin. Psoralen und Biotin sind von P und B bezeichnet sind. (B) COSMIC Schema. Zellen mit trifunktionellen Derivate von Polyamiden behandelt. Nach der Vernetzung mit einer 365 nm UV-Bestrahlung, Zellen lysed und genomische DNA geschert. Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen zugegeben werden, um Polyamid-DNA-Addukte zu erfassen. Die DNA wird freigesetzt und kann durch quantitative PCR (qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequencing (NGS) analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Die Vernetzung in lebenden Zellen Beginnen Sie mit ~ 2,5×10 7 H1 Zellen oder anderen kultivierten Zellen. HINWEIS: Diese Anzahl von H1-Zellen entspricht fünf 10-cm-Schalen (ca. 40% Konfluenz). Wachsen Zellen in E8 Medien auf einer Fläche, die pluripotenten Stammzellen unterstützt beschichteten Schalen (siehe Materialliste) und inkubieren sie bei 37 ° C in der feuchten Atmosphäre von 5% CO 2. Ernten Sie die Zellen enzymatisch (siehe Materialliste). Hinweis: Nicht …

Representative Results

Um ungleichmäßige Genom Fragmentierung und andere Variablen zu berücksichtigen, sollte die gereinigte DNA immer gegen eine Referenz von Eingang DNA normalisiert werden. Spezifisch für einen Locus von Interesse Primer können verwendet werden. Ist es hilfreich, auch analysieren, einen Ort, bei dem das Molekül nicht erwartet werden, zu binden, als eine negative Kontrolle. Wir sehen eine> 100-fache Steigerung der Polyamid-Belegung bei Bestrahlung mit 365-nm-Licht (Abbildung 2). <p class="jove_c…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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Referências

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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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