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Biologia

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Abstract

O genoma é o alvo de alguns dos mais eficazes agentes quimioterapêuticos, mas a maior parte destes fármacos não têm especificidade de sequência de ADN, que conduz a toxicidade dose-limitante e muitos efeitos colaterais adversos. Segmentação do genoma com pequenas moléculas específicas para a sequência pode permitir que moléculas com elevação do índice terapêutico e menos efeitos fora do alvo. -methylpyrrole N / N poliamidas -metilimidazole são moléculas que podem ser racionalmente concebidos para dirigir sequências de ADN específicos com precisão requintado. E diferentemente da maioria dos fatores de transcrição naturais, poliamidas podem se ligar ao DNA metilado e chromatinized sem perda de afinidade. A especificidade da sequência de poliamidas tem sido extensivamente estudada in vitro com a identificação do local cognato (CSI) e com abordagens bioquímicas e biofísicas tradicionais, mas o estudo de poliamida de ligação para alvos genómicos em células permanece indefinida. Aqui nós relatamos um método, a reticulação de moléculas pequenas para Isolate cromatina (COSMIC), que identifica os locais de ligação de poliamida em todo o genoma. Cósmica é semelhante a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), mas difere em dois aspectos importantes: (1) um photocrosslinker é empregue para permitir a captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de ligação de poliamida, e (2) a afinidade punho biotina é utilizada para purificar poliamida -ADN conjugados sob condições semi-desnaturante para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Cósmica é uma estratégia geral que pode ser usado para revelar os eventos de ligação de poliamidas e outros agentes quimioterapêuticos-alvo do genoma de todo o genoma.

Introduction

A informação para fazer cada uma das células no corpo humano é codificado no DNA. A utilização selectiva de informação que governa o destino de uma célula. Os factores de transcrição (TFS) são proteínas que se ligam a sequências específicas de ADN para expressar um subconjunto particular dos genes no genoma, e o mau funcionamento do TFS está associada ao aparecimento de uma ampla variedade de doenças, incluindo defeitos no desenvolvimento, cancro e diabetes 1,2. Estamos interessados ​​em desenvolver moléculas que podem se ligam selectivamente ao genoma e modulam redes reguladoras de genes.

Poliamidas composto de N -methylpyrrole -metilimidazole e N são moléculas de ADN que podem atingir com especificidades e afinidades que rivalizam com factores de transcrição naturais 3-6. Estas moléculas se ligam a sequências específicas no sulco menor do ADN racionalmente concebido. 4,5,7 -11 As poliamidas têm sido empregues para ambos reprimir e activar a expressão de g específicaenes. 4,12-19 Eles também têm interessantes antivirais e anticancerígenas 20-24 12,13,25-30 propriedades. Uma característica atraente de poliamidas é a sua capacidade de aceder a sequências de ADN que são metilados 31,32 e envolvidos em torno de proteínas histonas 9,10,33.

Para medir as especificidades de ligação abrangentes de moléculas se ligam ao DNA, o nosso laboratório criou o método identificador do site cognato (CSI). 34-39 A ocorrência previsto de locais de ligação com base em in vitro especificidades (genomescapes) pode ser exibido no genoma, porque o in vitro intensidades de ligação são diretamente proporcionais constantes de associação (Ka). 34,35,37 Estes genomescapes fornecer a introspecção em poliamida ocupação em todo o genoma, mas medir poliamida obrigatório em células vivas tem sido um desafio. ADN é empacotado firmemente no núcleo, o que poderia influenciar a acessibilidade de locais de ligação. A umccessibility destas sequências de ADN chromatinized para poliamidas permanece um mistério.

Recentemente, muitos métodos para estudar as interações entre as moléculas pequenas e ácidos nucleicos têm surgido. 40-48 A captura de afinidade química e sequenciamento de DNA massivamente paralelo (chem-seq) é uma tal técnica. Chem SEQ utiliza-formaldeído para reticular moléculas pequenas para um alvo genómico de interesse e um derivado biotinilado de uma pequena molécula de interesse para capturar a interacção ligando-alvo. 48,49

Formaldeído reticulação conduz a interações indiretas que podem produzir falsos positivos. 50 Desenvolvemos um novo método, a reticulação de moléculas pequenas para isolar cromatina (COSMIC), 51 com um photocrosslinker para eliminar esses chamados picos "fantasmas". 50 Para começar, nós projetamos e sintetizados derivados trifuncionais de poliamidas. Estas moléculas continha uma ligação a DNA-polyamide, um photocrosslinker (psoraleno), e um identificador por afinidade (biotina, Figura 1). Com poliamidas trifuncionais, que podem covalentemente capturar interacções DNA-poliamida com irradiação UV a 365 nm, um comprimento de onda que não danificar o DNA ou induzir reticulação não-psoraleno-base. 51 Em seguida, fragmentar o genoma e purificar o ADN capturado sob rigorosas, semi -denaturing condições para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Assim, vemos cósmicos um método relacionado com a Chem-SEQ, mas com uma leitura mais directa de ADN de direccionamento. Importante, a fraco (K 10 3 -10 4 M -1) a afinidade para o ADN de psoraleno não detectável impacto poliamida especificidade. 51,52 Os fragmentos de ADN enriquecidos podem ser analisados ​​por qualquer polimerase de reacção em cadeia quantitativa 51 (cósmicos de qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração 53 (COSMIC-seq). Estes dados permitem um projeto imparcial, guiada por genoma de ligantes que a Interagir com seus loci genômica desejado e minimizar os efeitos fora do alvo.

figura 1
Figura 1. poliamidas bioativos e esquema cósmico. (A) poliamidas Hairpin 1 – 2-alvo a sequência de ADN 5'-WACGTW-3 '. Poliamidas lineares 3 – 4 5'-alvo AAGAAGAAG-3 '. Anéis de N-metilimidazole estão em negrito para maior clareza. Círculos abertos e cheios representam N e N -metilimidazole -methylpyrrole, respectivamente. Praça representa 3-clorotiofeno, e os diamantes representam β-alanina. Psoralen e biotina são denotados por P e B, respectivamente. (B) esquema cósmico. As células são tratadas com os derivados de poliamidas trifuncionais. Após reticulação com irradiação UV a 365 nm, as células são lADN genómico ysed e é cortado. Contas magnéticas revestidas com estreptavidina para capturar são adicionados aductos ADN-poliamida. O DNA é liberado e pode ser analisado por PCR quantitativa (qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração (NGS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. A reticulação em células vivas Comece com 2,5×10 ~ 7 células H1, ​​ou outras células cultivadas. NOTA: O número de células H1 corresponde a cinco placas de 10 cm (aproximadamente 40% de confluência). Cultivar células em meio E8 em pratos revestidos sobre uma superfície que suporta as células estaminais pluripotentes (ver lista de materiais), e incubar a 37 ° C em atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Células colheita enzimática (ver Lista de Materiai…

Representative Results

Para ter em conta a fragmentação genoma não uniforme e outras variáveis, o ADN purificado deve sempre ser normalizadas contra uma referência de ADN de entrada. Os iniciadores específicos para um locus de interesse pode ser utilizado. É também útil para analisar um locus em que não se espera que a molécula para se ligar, como um controlo negativo. Vemos um aumento> 100 vezes na ocupação de poliamida, após irradiação com luz de 365 nm (Figura 2). DNA enrique…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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