Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

Summary

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Abstract

Het plantenhormoon auxine speelt een belangrijke rol in veel groei en ontwikkelingsprocessen, waaronder tropische reacties op licht en zwaartekracht. De oprichting van een auxine gradiënt is een belangrijke gebeurtenis die leidt tot phototropism en gravitropisme. Voorheen polaire auxine transport (PAT) bleek een auxine gradiënt vestigen in verschillende cellulaire domeinen van planten. Echter, Han et al. Onlangs aangetoond dat juiste auxine gradiënt vorming plasmodesmal-gemedieerde callose symplasmic verbinding tussen aangrenzende cellen is ook een kritische factor. In dit manuscript, de strategie om de rol van bepaalde genen, die phototropism en gravitropisme kan beïnvloeden door het veranderen van symplasmic verbinding via moduleren plasmodesmal callose synthese verheldering besproken. De eerste stap is om afwijkende tropische antwoorden van 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen mutanten of overexpressie lijnen van een gen te screenen met het wildtype. Deze eerste screeningkan leiden tot de identificatie van een reeks genen functioneren in PAT of het regelen van symplasmic connectiviteit. Het tweede onderzoek betreft de sortering van kandidaten die veranderde tropische reacties door het beïnvloeden van symplasmic connectiviteit te tonen. Om dergelijke kandidaten pakken, de beweging van een symplasmic tracer en de afzetting van plasmodesmal callose onderzocht. Deze strategie zou nuttig zijn om nieuwe kandidaat-genen die symplasmic verbinding direct of indirect tijdens de tropische reacties en andere ontwikkelingsprocessen kunnen reguleren verkennen.

Introduction

Planten, sessiele levende organismen hebben een zeer geavanceerde netwerk van cel-cel signalering naar diverse omgevingsstimuli aanpakken ontwikkeld. Trope reacties zijn een van de verschijnselen waarbij planten reageren op prikkels uit de omgeving. Planten vertonen twee belangrijke tropische reacties phototropism en gravitropisme. Fotosynthetische planten buigen in de richting van de lichtbron door phototropism om maximale energie te oogsten. Evenzo gravitropisme maakt de planten groeien naar het zwaartepunt. De fundamentele mechanisme dat leidt tot zulke tropische reacties impliceert asymmetrische gradiënt vorming van het plantenhormoon auxine ^1. De handeling van de lokale auxine gradient formatie goed gekarakteriseerd; de genen die betrokken zijn bij dit mechanisme te voorzien van een routekaart voor hormoon actie ^2-8. De specifieke positie van auxine efflux dragers, zoals PIN-GEVORMD (PIN) en P-glycoproteïnen, voert de beweging van auxine van het cytoplasma naar de celwand van donorcellen ^9,10. Furthermore, door de actieve H ⁺ / IAA symport activiteit van auxine instroom dragers, zoals AUX1 / LAX familie eiwitten, auxine is eindelijk geleverd aan de naastgelegen ontvanger cellen ^2,11,12. Deze gerichte beweging van auxine is bekend als polaire auxine transport (PAT). PAT leidt tot een differentiële auxine verdeling tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op verschillende omgevingsstimuli ^13,14. Bovendien, de verstoring van lokalisatie of expressie van een van deze auxine influx of efflux dragers leidt tot ernstige verandering in PAT, waarbij een verstoring van de auxine gradiënt oorzaken, wat leidt tot defecten in de ontwikkeling. Onlangs, Han et al. gemeld dat plasmodesmal verordening Ook moet de auxine gradiënt ¹⁵ handhaven. Tot op heden zijn meer dan 30 plasmodesmal eiwitten geïdentificeerd ^16. Van deze eiwitten is AtGSL8 gemeld als een sleutelenzym voor callose klanksynthese plasmodesmata (PD) en daardoor een belangrijke rol speelt in maintaining de PD uitsluiting op grootte limiet (SEL). Onderdrukte AtGSL8 expressie resulteerde in een vervormd auxine gradiëntpatroon leidt tot geen tropische reactie in tegenstelling tot wild type zaailingen ^15.

In dit manuscript, methoden om nieuwe kandidaat-genen die betrokken zijn bij PD regelgeving zijn voorzien verkennen. AtGSL8 werd gebruikt als een modeleiwit deze methoden te testen, omdat het een sleutelenzym bijdraagt ​​aan callose biosynthese PD. Door de zaailing-dodelijkheid van gsl8 knock-out mutanten ¹⁷ werden dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen gebruikt volgens een eerder gepubliceerd rapport ^15. De strategie die hier kan worden aangepast aan genen die zijn betrokken bij hypocotyl tropische reactie gecontroleerd door PD SEL screenen.

Protocol

1. Screening van mutanten met veranderde fototropische en gravitropic Responses Bereid 1x Murashige en Skoog (MS) Medium, pH 5,7, met 0,8% Agar Een dag voor het experiment. Voeg 800 ml dubbel gedestilleerd water om een ​​2 L erlenmeyer en roer met een magneetstaaf. Voeg 4,4 g MS zout in de conische kolf. Voeg 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) en roer totdat al het zout is opgelost. De pH van het medium op 5,7 met 1 M KOH. Breng het medium tot ee…

Representative Results

In de huidige setup, dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen van AtGSL8 [hierna dsGSL8 (+ dex / -dex)] werden gebruikt, zoals homozygote gsl8 T-DNA insertie mutanten worden zaailing dodelijk 18. Drie dagen oude geëtioleerde zaailingen van dsGSL8 en wild type zaailingen met ± dex werden blootgesteld aan phototropic en gravitropic stimuli. We vonden dat dsGSL8 (+ dex) zaailingen waren defectief in phototropism en gravitropisme <…

Discussion

In dit manuscript, een strategie voor mutant / overexpressie lijnen die defect in phototropic en gravitropic reacties zijn vanwege veranderde PD callose en derhalve PD SEL wordt beschreven screenen. PD callose synthese en afbraak wordt vooral bereikt door callose synthases en β-1,3-glucanasen, maar regulering van deze enzymen wordt door vele factoren upstream. Om te zoeken naar een dergelijke upstream factoren of kandidaten die rechtstreeks betrokken zijn bij PD regelgeving, hebben we het opzetten van deze methode voor…

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds