Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için
Summary
Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.
Abstract
Bitki hormonu oksin ışık ve yerçekimine tropik yanıtlar dahil olmak üzere birçok büyüme ve gelişim süreçleri, önemli bir rol oynar. Bir oksin degrade kurulması Fototropizma ve Gravitropizma giden bir anahtar olaydır. Daha önce, kutup oksin nakil aracı (PAT) farklı bitki hücre domeni bir oksin gradyanı oluşturulması gösterilmiştir. Bununla birlikte, Han ve ark., En son, uygun oksin gradyan oluşumu için, komşu hücreler plasmodesmal kaloz aracılı symplasmic bağlantısı da kritik bir faktör olduğunu göstermiştir. Bu yazıda, strateji plasmodesmal kaloz sentezini modüle yoluyla symplasmic bağlantı değiştirerek Fototropizma ve Gravitropizma etkileyebilir belirli genlerin rolünü aydınlatmak için, tartışılmıştır. İlk adım, vahşi tip ile mutantların veya bir genin aşırı ifade çizgileri 3 günlük bir soluk fidelikler gelen anormal tropik yanıtları ekrana. Bu ön elemePAT fonksiyonlu veya symplasmic bağlantı kontrol eden gen bir dizi tanımlanmasına yol açabilir. İkinci tarama symplasmic bağlantı etkileyerek değişmiş tropik tepkileri göstermek adayların sıralamasını içerir. Bu tür adayları ele almak için, bir symplasmic izleyicinin hareketi ve plasmodesmal kaloz birikimi incelendi. Bu strateji tropik tepkiler ve diğer gelişim süreçleri sırasında doğrudan ya da dolaylı symplasmic bağlantı düzenleyen yeni aday genleri keşfetmek yararlı olacaktır.
Introduction
Bitkiler, sapsız yaşam organizmalar gibi çeşitli çevresel uyaranlara yönelik hücre-hücre sinyalizasyon son derece sofistike bir ağ geliştirdi. Tropik tepkiler bitkiler çevresel uyaranlara yanıt hangi olayların biridir. Bitkiler iki tropik yanıtları Fototropizma ve Gravitropizma göstermektedir. Fotosentetik bitkiler maksimum enerji hasat bilimciler tarafından ışık kaynağına doğru bükün. Benzer şekilde, Gravitropizma yerçekimi merkezine doğru bitkilerin büyümesini sağlar. Bu tür tropik yanıtlara önde gelen temel mekanizma fitohormondur oksin 1 asimetrik gradyan oluşmasına yol açar. Yerel oksin degrade oluşumunun hareket iyi karakterize edilir; Bu mekanizmanın katılan genler hormon eylem 2-8 için bir yol haritası sunar. Oksin pimin şekillendirilmiş (PIN) ve akış taşıyıcı ve p-glikoproteinler spesifik konumu, donör hücrelerin 9,10 hücre duvarına sitoplazmadan oksinin hareketini gerçekleştirir. Furthermore, örneğin AuX1 / lax aile proteinleri gibi oksin akışı taşıyıcı, aktif H + / IAA symport aktivitesi ile, oksin son komşu Alıcı hücrelere 2,11,12 teslim edilir. oksin Bu yönlü hareket Polar oksin taşınmasının (PAT) olarak bilinir. PAT, çeşitli gelişim aşamalarında farklı çevresel uyaranlara 13,14 yanıt olarak, bir diferansiyel oksin dağılımına yol açar. Ayrıca, bu oksinin akını ve akış taşıyıcı herhangi bir lokalizasyonu ve ifade bozulması gelişim hatalara yol açan, oksin gradyanı bir aksamaya neden PAT ciddi bir değişikliğe yol açar. Son zamanlarda, Han ve ark. plasmodesmal düzenlemesi oksin gradyanı 15 korumak için de gerekli olduğu bildirilmektedir. Bugüne kadar, 30 dan fazla plasmodesmal proteinleri 16 tespit edilmiştir. Bu proteinler arasında, AtGSL8 plasmodesmata (PD) en kaloz sentezi için önemli bir enzim olarak bildirilmiştir ve bu nedenle maint önemli bir rol oynar edilmiştirPD boyut dışlama sınırı (SEL) Aining. Bastırılmış AtGSL8 sentezleme vahşi tip fide 15 aksine hiçbir tropik cevap sağlayan bozuk bir oksin gradyan modeli ile sonuçlanmıştır.
Bu yazıda, yöntemler temin edilmiştir PD düzenlenmesinde rol yeni aday genleri keşfetmek için. Bu kaloz biyosentezini PD katkıda bulunan önemli bir enzim olduğu AtGSL8, bu yöntemleri test etmek için bir model protein olarak kullanılmıştır. Nedeniyle knock-out gsl8 mutantlar 17 fide-öldürücülüğü için, deksametazon (dex) -inducible RNAi hatları, daha önce yayınlanan raporda 15 uyarınca kullanılmıştır. Burada sağlanan bir strateji PD SEL kontrol hipokotil tropik yanıt olarak implike genleri taranması için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, bir stratejisi, bu nedenle, PD SEL ayrıntılı olarak anlatılmıştır değiştirilmiş PD kaloz ve e phototropic ve gravitropic yanıtlarında arızalı mutant / aşırı ifade çizgileri ekranlanması için kullanıldı. PD kaloz sentezi ve parçalanması esas kaloz sentaz ve β-1,3-glukanaz ile gerçekleştirilir, ancak bu enzimlerin düzenlenmesi çok yukan faktörlerle kontrol edilir. Böyle yukarı faktörler veya doğrudan PD düzenlenmesinde rol adaylar aramak için, biz tarama için bu yöntemi k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-2015R1A2A1A10053576) tarafından desteklenmiştir ve Nesil BIOGREEN 21 Programı'nın bir hibe ile (SSAC, PJ01137901 hibe), Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti. RK, WS, ABB ve DK Beyin Kore 21 Artı programında (BK21 +) tarafından desteklendi.
Materials
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
Referências
- Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. Phytohormones. Experimental biology monographs. , 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
