Summary
우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.
Abstract
혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 - 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 - 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.
Introduction
분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4.
VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체.
이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 - 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다.
우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 - 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다.
생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 - 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다.
우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다.
우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.
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Protocol
IL-3의 제조의 소스 WEHI-3D 에어컨 중간
주 : 마우스 과립 구성 백혈병 세포주 WEHI-3D는 IL-3을 함유하는 합성 배지를 생성하기 위해 배양한다.
- 둘 베코 변형 이글 배지에서 배양 WEHI-3D (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 긴 수명 글루타민 보충제, 50 μg의가 / ㎖ 젠타 마이신. T175의 cm 3 조직 배양 플라스크에서 신선한 배지 50 ㎖로 성장 로그 단계에서 5 × 106 세포를 접종하고 약 7 일 동안 성장 또는 세포를 약 24으로 성장 그 로그 상을 통과 할 때까지 - 48 시간 (문화 과도한 세포 사멸을 방지). 500 mL를 한번에 제조 할 수있다 - (200)의 배치가되도록 조정 배지는 -20 ° C에서 여러 해 동안 저장 될 수있다.
- 15 분은 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 1,000 × g으로 플라스크와 스핀에서 유체 및 세포를 가만히 따르다. supern의 최고 90 %를 제거atant. 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 필터링합니다.
- 1 ml를 50 mL 및 -20 ° C에서 저장을위한 200 ml의 볼륨 또는 -70 ° C ~로 나누어지는 WEHI-3D 에어컨 매체 (CM). 작은 분취 량의 장기 저장을위한 분석 준비 인자 의존적 세포주의 통과를위한 배양 배지를 제조하기위한 중간 볼륨 큰 볼륨에 유용하다. IL-3는 무균 조건 하에서 사용하는 경우 너무 해동 매체가 몇 주 동안 저장 될 수있다 4 ° C에서 상대적으로 안정적이다.
- 대안 적으로, 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 여과 된 후 배지로 희석하여 50 ng를 / ㎖의 농도로 재조합 마우스 IL-3를 사용한다.
VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 및 제어 바 / F3 셀 라인 2. 문화 및 평가
- DMEM에서 배양 바 제어 / F3 세포를 10 % FBS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 또는 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 안정화. 세포로부터 3 일에 대한 1시 15분 희석에서 통과 세포로그 상에 성장합니다.
- DMEM에서 배양-VEGFR2 EPOR-BA / F3 세포를 10 % FBS가를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 및 1 ㎎ / ㎖의 G418을 안정화. 로그 상에 성장하는 세포에서 1시 15분 희석에 통로 세포. 키메라 수용체의 구조와 표현에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오.
- 중앙 로그 상 문화에서 수확 제어 바 / F3 또는 VEGFR2-EPOR - 바 / F3 세포. 천천히 플라스크의 바닥으로부터 이들 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 피펫. 매체 IL-3를 함유 제거 (세포 펠렛을 회수하기 위해 5 분 동안 750 x g에서 10 ㎖, 원심 분리), 마우스 긴장성 인산 완충 식염수, pH가 7.3 (PBS)으로 세 번 세척 하였다.
- 10,000 세포 당 후 세척 상기 WEHI-3D-CM 또는 재조합 IL-3없이 회 DMEM 및 첨가제와 함께 세포, 및 7.4 × 104 세포 / ㎖ (즉, 13.5 μL 당 1000 세포의 농도로이 배지에 재현 탁 혈구를 사용하여 계산에 의해 결정된 135 μL)에 대한각각 분석의 반 정량적 또는 정량 버전에서 사용할 수 있습니다.
- 트리 판 블루 제외 (주의)에 의해 생존을위한 세포를 평가합니다. 세포 집단으로 1 혈구 100 셀들의 최소 개수 : PBS (0.4 %) (1)에 트리 판 블루를 섞는다. 염료을 차지 세포가 죽었거나 죽어 간주됩니다. 98 % 이상의 생존율 분석을 수행 할 필요가있다.
3. 반 정량 분석
- RT에서 72 웰 마이크로 웰 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 매체의 13.5 μL에 포함 된 세척 세포 (1,000 세포)를 추가합니다. 중력 바이어스 세포 농도를하지 않습니다에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의하십시오. 잘 보정 P20 자동 피펫 및 멸균 팁을 사용합니다.
- 교정 P20 피펫 또는, 바람직하게는, P2 피펫을 사용하여 (물론 1,000 세포를 포함하는 15 μL의 최종 볼륨을, 1.5 μL) 10 % 볼륨 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 캘리포니아를 타고재는 샘플의 pH, 소금 및 기타 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인합니다. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예를 들면, DMEM 또는 PBS, 각각) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 같은 팁 분쇄 혼합 보장합니다.
- 대조 시료를 들어, (ⅰ) 보통 단독으로 함유 더 포함 IL-3,하지 (ⅱ) WEHI-3BD CM-10 %의 최종 부피에서 단독 배지에 첨가; 및 / 또는 (ⅲ) VEGF-A에는 IL-3를 함유하지 않는 단독 배지에서 100ng의 / ㎖로 희석 하였다.
- 멸균, PBS 또는 매체와 마이크로 웰 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채우고 수 있도록 가스 교환 (물 티슈 페이퍼 젖과) 가습 컨테이너 내에서 접시를 놓습니다. 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 컨테이너 내에 세포를 인큐베이션. 테스트 샘플 및 미디어 구성 요소를 사용할 수있는 경우이 분석은 편안하게 한 사람이 3 시간에 설정할 수 있습니다.
- 일반적으로 16 시간 후 번호판을 평가배양이되는 포지티브 및 네거티브 샘플 사이의 시간 차별은 분명하다. 세포 배양에 표시하는 방법의 예 그림 3을 참조하십시오. 100 × 배율 - 40 표준 역 위상차 현미경을 사용하여 번호판을 분석합니다.
참고 : 웰스 둥근 반투명 표시 셀을 포함 이러한 IL-3 또는 VEGF-A로지지 성장 인자를 포함. 지지 성장 인자없이 또는 배지 단독 웰 둥근 세포뿐만 아니라 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 찌꺼기 (예컨대,도 3c)의 수를 감소한다. 24 ~ 48 시간 게시물 배양에서 분석 평가하는 것은 감도 최적입니다.
4. 양적 생물 검정
- RT에서 표준 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 배지에서 세정 균체 (135 μL 10,000 세포)를 추가한다. 가전 영향을주지 않습니다 중력에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의LL 농도.
- 10 % 볼륨 (15 μL) 보정 피펫 (P20)를 사용에서 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 샘플의 pH, 소금 또는 다른 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인하기 위해주의하십시오. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예., DMEM 또는 PBS) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 필터는 0.22 ㎛의 세공 셀룰로오스 아세테이트 원심 관 필터 유닛을 이용하여 소량 살균.
- 48 시간 동안 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포 성장 인자 및 / 또는 억제제 제의 혼합물을 인큐베이션. 물에 적신 휴지를 가지고 있으며, 가스 교환을 할 수있는 가습 컨테이너 내에서 분석을 수행합니다. 잘 내 생존 세포 수의 대용 마커 배양 기간의 종료에서, 이는 아래에 나열된 다른 방법 중 하나를 사용하여 분석 평가이다.
- 대안 1 : 3 H-thymidi북동 설립
참고 :이 정량은 96 웰 플레이트 형식을 위해 설계되었습니다.- 37 ° C (웰 당 150 ㎕의 부피)에서 48 시간 동안 분석 플레이트를 배양 한 후 (IL-3 / WEHI-3D CM없이 학사 / F3 배지) 분석 배지 50 ㎕의 부피로 3 H 티미 딘을 추가 웰 당 1 μCi를 최종 투여 20 μCi를주고 잘 / ml의 농도로 당.
- 셀 수확기를 사용하여 세포를 수확하기 전에 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 접시를 품어. 섬광에 필터를 배치하여 각각의 샘플을 추출하여 액체 섬광 계수기로 정량화.
- 대안 # 2 : 셀룰러 ATP의 생물 발광 검출
주 :이 방법은 집단의 생존 세포를 반영하는 생물 발광 신호를 생성 할 수있는 세포 용 해물과 결합 된 ATP 모니터링 시약을 사용한다.- 를 Lyse 세포 ATP를 추출하고, 생성하는 ATP 모니터링 시약을 사용제조업체의 지시에 따라, 발광 신호를 출력한다. 96 웰 플레이트 형식과 호환 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오.
- 대안 3 : 실행 가능한 세포에 의한 표시 염료의 효소 감소
참고 : 레사 주린 기반 분석은 세포 생존에 좋은 상관 관계를 보여줍니다.- 레사 주린 계 염료로 배양 된 세포를 결합하고 제조자의 지시에 따른 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 정량화.
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Representative Results
이 섹션에서는, 우리는 VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정 (분석의 원리 그림 1 참조)의 필수 기능을 보여주는 실험의 결과를 보여줍니다. 다른 발표 된 연구는 다른 VEGFR-2 리간드, 돌연변이 VEGF 분자 및 저해 모노클로 날 항체 8,10,19,24-30에 대한 분석의 광범위한 응용 프로그램을 보여줍니다.
여기에 제시된 데이터는 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법은 세 가지 재조합 인간 리간드 (VEGF-165, VEGF-C 및 VEGF-D) VEGFR 대한 특이 활성을 정량화하는데 사용되는 분석법을 나타낸다 -2 저해 성 모노클로 날 항체 (베바 시주 맙)의 존재 하에서 VEGF-A (165)의 데이터는 VEGF-A (165)를 단독 (도 2)에 대한 응답 대 정규화되었다. 예상대로, 베바 시주 맙은 VEGF-A 분석 165의 효과를 차단하지만,VEGF-C 및 VEGF-D의 활성에 영향을 미치지 않았다.
분석의 진행 상황에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있는 표준 역 위상 현미경을 이용하여 분석을보고, 그 개발 기간 동안 분석을 관찰 할 때 분석의 반 정량적 버전 또는. VEGFR-2, 예를 들어 VEGF-A를위한 매체 IL-3을 포함하는, 또는 리간드와 함께 배양했을 때 분석 (도 3)의 분석 VEGFR-2 EPOR-BA는 / F3 생물 검정법 세포의 우수한 생존율을 나타낸다. 이들 세포는 많은 반투명하고, 배양 세포의 세포질 또는 세포 파편 입도 없거나 최소한의 증거는 없다. 잘 추가 성장 인자와 감소 세포 수와 몇 건강한 세포의 증거가 이미 있습니다. 본 세포는 세포질에 중요한 단위가 세포 파편은 문화의 일관성있는 기능입니다. 48 시간 후 생존 세포의 흔적이 없다.
VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 분석의 원리를 설명하면도 1 회로도. (A) 학사 / F3 세포 인자 의존적이며 같은 외인성 성장 인자를 필요 IL-3을 통해 세포 성장 / 생존 자극 내인성 IL-3 수용체 및 JAK 신호 전달 경로. EPOR이 셀 구조로 표현하는 경우도 JAK 경로를 통해 발생할 수 있습니다. 이러한 VEGFR-2 활성화의 다운 스트림 대상으로 최소한의 신호에 VEGFR-2의 결과로 전체 길이 수용체 티로신 키나제의 발현은 JAK 경로를 관여하지 않습니다. 바륨 / F3 세포에 형질 때 EPOR의 막 횡단 및 세포질 영역에 융합 VEGFR-2의 세포 외 영역과 키메라 수용체 특정 VEGFR-2 리간드 자극은 JAK 경로를 활성화하고 세포를 구동 할 수있다생존과 증식. (B) VEGFR-2 EPOR-BA / F3 세포는 유세포 정량화 할 수있는 키메라 VEGFR-2 수용체 EPOR 상당한 수준의 표현. 일단 IL-3 함유 배지에서 세정 한 후, 세포는 세포 생존 / 증식를 유도 배양 조건의 다양한 배치된다. 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포 또는 VEGFR-2-EPOR - 바이 / F3 셀 특정 성장 인자없이이 / 성장 생존하지 못한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 마우스 VEGFR-2 EPOR 키메라를 발현 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법. IL-3 의존적 학사 / F3 세포에서 VEGFR-2 리간드 평가하기 (IL-3없이 매체에 시딩 ...에 대한+ IL-3 서브 세트 표시) 더하기 인간 VEGF-A (165), VEGF-CΔNΔC (VC) (이는 중앙 영역으로 구성하고, N과 C 말단 propeptides 제외 VEGF-C의 형태) 또는 VEGF-DΔNΔC (이 중앙 영역을 포함하고 제외 VEGF-D의 형태 인 N과 C 말단 propeptides (VD))와 결합하여 VEGF-A 억제 100 NG / ㎖ 및 인간화 중화 모노클로 날 항체 베바 시주 맙 (AT, 하지만 VEGF 또는 VEGF-C-D), 또는 0.75 μM에서 나타낸 바와 같이, 항체 트라 스투 주맙 비 중화 제어한다. 추가로 성장 인자를 함유하지 NF = 매체. 48 시간 후, 상대 생균 수는 세포의 ATP 생물 발광 검출을 이용하여 정량 하였다. 수직 막대와 3 개의 독립적 인 실험의 평균의 표준 오차 (혼자 VEGF-A (165), 첫 번째 막대에 대한 응답 대 정규화) 수단을 나타냅니다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.
그림 3. VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 세포는 생존을위한 외부 성장 요인에 따라 달라집니다. VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정의 예는있는 IL-3에 의존 바 / F3 세포는 마우스를 표현 VEGFR- 2 EPOR 키메라 10 % WEHI-3D는 IL-3, (B) 100 NG / ㎖로 인간 VEGF-A 165 (NO IL-3), 또는 (C) 매체를 제공 매체 에어컨 함유 배지 (A)에 시딩 아니오 IL-3 또는 추가적인 성장 인자. 배양은, IL-3 (A) 또는 VEGF-A 165 (B)의 존재 하에서 고도로 생존 세포를 나타내는 분석에 24 시간을 나타낸 반면없는 IL-3 또는 추가적인 성장 인자 (C) 세포의 사멸과 함께 배양하고 빨간uced 생존 명확하게 알 수 있습니다. 바는 100 μm의입니다 조정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지에 IL-3 포함 매체로부터 세정 될 필요가있다. 리간드는 상이한 형태의 숫자에 올 수있는 바와 같이, 케어 시금 이러한 제조 할 때 수행되어야한다. 방부제, 항균제, 소금 또는 다른 산도의 버퍼 분석에 영향을 미칠 수 있고, 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포의 병렬 테스트 버퍼 관련 문제에 대해 알릴 수 있습니다 이유입니다.
우리는 모두에게 반 정량 및 정량 프로토콜을 사용합니다. 반 quantitati적이 분석은 이전 시간과 샘플을 요구하는 완전히 정량 분석에 투입, 샘플의 활성의 신속한 평가를 허용한다. 게시에 대한 데이터를 생성 할 때 정량적 방법이 독점적으로 사용됩니다. 배양 가능성을 검출하기위한 다른 방법은 비교적 간단하다. 정량 분석은 증식 정량 다른 포맷의 수에 적응 한 내용 및 우리가 사용한 (3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드) MTT (30), 휴대 ATP (미 출판), 레사 주린 계 염료 (그림 2) 성공 3 H-티미 딘 (31)의 생물 발광 검출. 최근에서는 생물 발광 방식을 적응 방사선의 사용으로 얻어 진화 및 경제성으로 인해 기반 레사 주린 염료를 사용했다. 접근법 모두는 적절한 결과를 제공하고, 선택 시약의 이용하고 A에 의존특정 방식으로 주어진 실험실 / 연구소 또는 친숙 전문 플레이트 리더를 지을.
문제 해결 분석의 세 가지 주요 구성 요소, ⅰ) IL-3 CM, ⅱ) VEGFR-2-EPOR - 바이 / F3 세포 및 ⅲ) 자극 리간드의 활동을 중심으로 돌아 가지. 때문에 초기 문화에 부적절한 WEHI 3D 세포, 가난한 보관 조건, 과도한 동결 융해 사이클 또는 분석을 방해합니다 저조한 성장 문화를 만들 수 있습니다 너무 높은 희석에 사용하는 IL-3 CM에서의 빈약 한 수준. 세포 인구가 정상 밝고 둥근 모양을 잃고, 천천히 성장으로 이것은 일반적으로 제어 우물에서 발견된다. 장기간 배양에 보관하면 VEGFR-2-EPOR-BA는 / F3 세포 분석은 시간 키메라 구조의 세포 표면 발현을 잃을 수있다. 액체 질소 주식의 좋은 번호를 유지하는 것은 매우 키메라 수용체를 발현하는 세포의 신선한 문화가 항상 사용할 수 있습니다. 필요한 경우, 높은 인구 표현 될 수있다VEGFR-2 리간드의 세포 성장 및 정렬 유세포 키메라 수용체의 높은 수준의 발현 집단을 선택하였습니다. 이 세포는 더 동결에 대한 문화에 확장됩니다.
이 기술은 VEGFR-2 세포 외 도메인의 상호 작용을 분석 더욱 단순화 대안있는 동안 차 내피 세포에 천연 수용체 다른 VEGFRs 공동 수용체 등의 존재 프로빙 더 정교한 실험을 대체 볼 수없는 neuropilins. 이 분석의 기초가되는 세포 (B 세포)는 내피 세포와 구별하고, 따라서 내피 세포에서 VEGFR-2의 활성화에 반응하는 세포질 신호 전달 경로 및 전사 인자를 연구하는 데 사용되어서는 안된다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 고정화 레셉과 리간드의 상호 작용을 조사하는 간단한 결합 분석 사이에있는 수용체 - 리간드 상호 작용을 분석하기위한 유용한 방법을 제공한다토와 수용체 결합 분석 및 차 내피 세포 결합 분석에서 본 하류 효과 (예를 들면, 가용성 수용체의 세포 외 영역 또는 면역 글로불린 융합 수용체의 세포 외 영역으로) 구성. 이 수용체의 결합 및 가교는, 처음 두 단계가있는 많은 유형 수용체 티로신 키나제는 그들의 일반적으로 신호 전달 캐스케이드를 개시 할 수 있도록하는 시스템을 제공한다. 학술 및 상업 설정의 숫자에있는 그것의 응용 프로그램은 변형 리간드 또는 수용체 - 리간드 상호 작용의 억제제를 평가, 특히이 바인딩 특성을 조사하기위한 유용한 분석으로 허용됩니다 보여 주었다.
분석은 또한 수용체 세포 외 도메인 또는 리간드의 새로운 억제제의 분석에 유용합니다. 분석은 또한 인간에서 발견 GE (모두 상속 체세포) 빠르게 유전자 돌연변이의 맥락에서 볼 수있는 리간드 또는 수용체의 세포 외 영역의 변이체를 스크리닝하기 위해 사용될 수있다암 (32, 33)과 같은 질병에 NES는 기능적 결과를 확인합니다. 따라서 본 VEGFR-2 분석의 어플리케이션은 향후 확장 가능성이 높다. 또한,이 분석을 기초 일반적인 방법은 더 넓게 건강과 질환에서의 신호 전달 분자의 큰 중요한 가정을 구성하는 세포 표면 수용체 티로신 키나제에 대해 이용 될 수있다.
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Disclosures
스티븐 A. 스태커 및 마크 M. Achen은 일주기 기술 (주), 성장 인자의 VEGF 가족을 대상으로 치료제를 개발하는 회사의 주주입니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester | |
Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
Fluorescence Reader | BioTek | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
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