Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Summary

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Abstract

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Introduction

As células estaminais adultas (SCS) são essenciais para a manutenção da homeostase do tecido, substituindo células que morrem e reparar tecidos danificados após a lesão. Estes SCs são definidas pela sua capacidade para sofrer auto-renovação contínua e de se diferenciar em linhagens celulares diferentes ^1-3. Os sistemas mais bem estudados, as quais são dependentes de SCs adultos para a sua reposição, incluem o sistema hematopoiético, o intestino e o ^1,2,4 pele.

Durante a embriogénese, a pele começa como uma única camada de células epidérmicas. Morfogênese do folículo piloso (HF) começa quando as células mesenquimais preencher a pele e formam uma subjacentes derme colágenas ^5. Especializada células mesenquimais, que mais tarde constituem a papila dérmica (DP), organizam diretamente abaixo da camada epidérmica e estimulam o epitélio para formar placodes cabelo que começam a crescer para baixo ^6. Altamente proliferação de células da matriz, situados na parte inferior do HF,envelope estas células mesenquimais e formar o bulbo capilar, enquanto que a camada interna começa a diferenciar-se em cilindros concêntricos de modo a formar o eixo do cabelo (HS) e a bainha envolvente interior raiz (IRS) ^2,3.

Na vida pós-natal a epiderme da pele é composta de três compartimentos: a epiderme interfoliculares (IFE), a glândula sebácea (SG) e o HF. Em contraste com o IFE e SG, que estão em constante estado de homeostase, o HF é um mini-órgão dinâmico que sofre ciclos contínuos de crescimento (anágena), destruição (catágena) e repouso (telógena) ^4,7. As células-tronco do folículo piloso (HFSCs) que o combustível este ciclo perpétuo, residir em um nicho especializado dentro do HF conhecido como o bojo ^4. Durante anágena os HFSCs sair do bojo, seguindo sinais de ativação do DP, começam a proliferar e descer para baixo, criando assim uma trilha linear longo de células conhecidas como a bainha externa da raiz (ORS) ^8-10. As células da matriz, quecercar o DP na base de HF, rapidamente ciclo e migrar para cima passando por diferenciação terminal gerando assim o HS e o IRS ¹⁰ (Figura 1). A duração do anágeno determina o comprimento do cabelo e é dependente da capacidade proliferativa e de diferenciação das células da matriz ^6. Quando o HF entra catágena, as células da matriz-amplificação de trânsito na cessar lâmpada a proliferar, sofrem apoptose e regridem completamente enquanto puxa o DP para cima até que ele atinja a parte não-ciclismo do HF ^8,11. Durante esta retracção, o HF forma uma estrutura temporário conhecida como a cadeia epitelial, que é característica de catágena e contém muitas células apoptóticas. Em ratinhos, catágena dura entre 3-4 dias e é altamente sincronizadas no primeiro ciclo do cabelo. Quando o HF atinge todos os telógena HFSCs se tornar quiescente. As diferentes etapas do ciclo de IC também são caracterizadas por alterações na cor da pele do rato devido a mprodução elanin. As alterações na pele de preto durante anágena ao cinza escuro durante catágena a rosa durante telógeno ^6,7,12,13.

Figura 1: O ciclo de folículo piloso. O HF é composto por uma parte superior permanente e um menor em constante remodelação, a porção de ciclismo que sofre ciclos contínuos de crescimento rápido (anágena), destruição (catágena) e uma fase de quiescência parente ou repouso (telógena). Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Os SCs mantendo a HF foram inicialmente identificados utilizando experimentos de perseguição, com timidina tritiada, que revelaram uma população de células de retenção lenta etiqueta ciclismo (LRC) que residiam na região permanente do HF logo abaixo da SG ^14. Avanços na HFSCCaracterização revelou um pequeno número de marcadores que podem ser utilizados para identificar e isolar SCs específicos do nicho da IC ^15. Talvez o melhor marcador para o enriquecimento de células CD34 é HFSCs, um marcador de superfície celular também identificado como um marcador SC hematopoiéticas em seres humanos ^16. Dentro deste CD34 ⁺ populações duas populações distintas também foram isoladas com base na expressão da integrina α6 ^2. Outro marcador é queratina 15 (K15), que é altamente expresso na região da protuberância, co-localiza com a expressão de CD34 e um promotor K15 é usado para o direccionamento e isolando HFSCs em animais transgénicos ^15,17-19. Na década passada várias outras populações distintas de células progenitoras HFSCs e também têm sido relatados para residir dentro do IC ^17,20-27.

Um recurso interessante adicional de HFSCs é a sua contribuição para a reparação da pele. Em condições normais HFSCs reabastecer o HF e não tomar parte em IFE homeostase. HoweVer, em resposta ao ferimento, estas células sair do seu nicho SC e ajuda na repovoamento a IFE ^9. Nós demonstramos recentemente que os ratinhos excluído para a exibição do gene SEpt4 / ARTE pró-apoptótica um aumento do número de células CD34, K15 e Sox9 ⁺ HFSCs, que demonstram uma resistência à apoptose. HFSCs foram isolados a partir SEpt4 / ARTE ^{– / –} peles dorsal utilizando células activadas por fluorescência (FACS) e não havia mais do que um aumento de duas vezes no número de células CD34 ⁺ e ⁺ K15 HFSCs. Estes SEpt4 / ARTS ^{– / –} HFSCs foram expandidas in vitro e não só deu origem a mais colónias, mas também foram capazes de suportar as condições mais severas, em comparação com controles ^28.

Como resultado de ter um maior número de HFSCs, SEpt4 ARTE / ^{– / –} ratos curados significativamente mais rapidamente em resposta a lesões excisão de pele. Surpreendentemente, SEpt4 / Artes ^{– / –} ratos displayeda grande número de HF regenerado a partir do leito da ferida, cicatrizes e significativamente menores. Além disso, os ratos excluídos para XIAP (inibidor ligada ao X de apoptose), o alvo bioquímico de ARTS, demonstrou prejudicou a cicatrização ^28.

Os nossos resultados e trabalho realizado em outros laboratórios mostraram que HFSCs servir como um modelo ideal para o estudo da biologia e função de SCs adultos. Aqui, nós descrevemos a metodologia para o enriquecimento e isolamento de HFSCs e queratinócitos epidérmicos com base na expressão de quatro marcadores: α6 integrina; β1 integrina; Sca-1 (um marcador para queratinócitos epidérmicos) e CD34. Semelhante isolamento de K15 ⁺ HFSCs também pode ser realizada utilizando o rato K15 repórter ^GFP-19.

Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Ministério da Saúde de Israel. Todos os animais foram tratados de acordo com o protocolo animais cuidado institucional aprovado IL-02302-2015 do Technion Israel Institute of Technology. 1. Preparação Experimental Preparação de Soro Fetal Bovino quelatado Nota: As células epiteliais são muito sensíveis ao cálcio por isso é c…

Representative Results

Este protocolo descreve em pormenor o enriquecimento e isolamento de dois tipos de populações:. Protuberância SCs queratinócitos epidérmicos e A Figura 2 ilustra as principais etapas do protocolo. Utilizando a pele dorsal removida da parte de trás de ratinhos com 8 semanas, que enriquecido SCs protuberância usando o marcador CD34, que é expresso apenas em HFSCs; e Sca-1, que rotula queratinócitos epidérmicos. A Figura 3 mostra diferentes padrõ…

Discussion

O protocolo aqui descrito está bem estabelecida para isolamento de HFSCs da pele dorsal de ratos adultos, mas pode ser igualmente aplicado para o isolamento de outras populações no interior da estrutura de HF, baseado na selecção de marcadores ^{2,16,23,28,29.} Este método é especialmente vantajosa em relação a outros métodos de isolamento de células, tais como a dissociação de tecidos, em que um tipo específico de célula pode ser seleccionada e colhida a partir de uma mistura de populações de c…

Materials

Isoflurane	Primal Critical Care	66794-017-10
Carbon dioxide	–	–
Electro Shaver	Oster	Golden A5	Shaver from any other company could be used
70% ethanol	Gadot Lab	830000051	96% ehtanol diluted with distilled water
Dissection mat			Dissection tools from any provider can be used
Forceps	Dumont	11251-10	Foreceps from any other company could be used
Scissors	Dumont	14094-11	Scissors from any other company could be used
Needles/Pins	–	–
Scalpel	Albion	10	Ensure that the scalpel has a blunt end
Tissue culture dish 60mm x 15mm	Sigma-Aldrich	CLS430166
PBS	–		In-house PBS without Calcium and Magnesium
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-050-1A	Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly
Pipettes 10ml	Sigma-Aldrich	Corning, 4488
Ice	–	–
50 ml sterie centrifuge tubes	Minplast Ein-shemer	35050-43
70µM Cell strainer	Fisher	22362548
40µM Cell strainer	Fisher	22362549
Staining buffer	–
Centrifuge	Eppendorf 5804 R	5805 000.017
FACS tubes with Cell strainer caps	Falcon	352235
FACS tubes	Falcon	352063
Integrin β1	eBioscience	25-0291	1:400
Integrin α6	eBioscience	15-0495	1:600
Sca I	eBioscience	11-5981	1:200
CD34	eBioscience	9011-0349	1:300
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	50ng/ml
Dry Chelex	BioRad	142-2842
Beaker	Pyrex	–
Distilled H2O	–	–
Stir bar	–	–
NHCl	BioLab	1903059
Fetal bovine serum (FBS)	Beit Haemek Biological Industries	400718	FBS obtained from a different company can be used
1L glass bottle	Ilmabor	Boro 3.3
Bottle top filter	Autofil	1102-RLS