Разделительный волосяного фолликула стволовых клеток и кератиноцитов эпидермиса из кожи Спинной мыши

Summary

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Abstract

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Introduction

Взрослые стволовые клетки (SCS) необходимы для поддержания гомеостаза тканей путем замены умирающие клетки и восстановления поврежденных тканей после повреждения. Эти Стволовые определяются их способности претерпевать постоянному самообновлению и дифференцироваться в различные клеточные клоны ^1-3. Наиболее изучены системы, которые зависят от взрослых ГКС для их пополнения, включают в себя систему гемопоэза, кишечник и ^1,2,4 кожи.

Во время эмбриогенеза, кожа начинает как один слой эпидермальных клеток. Морфогенез волосяного фолликула (HF) начинается , когда мезенхимальные клетки заселить кожу и образуют основные коллагеновые дермы ^5. Специализированные мезенхимальные клетки, которые впоследствии составляют сосочков дермы (DP), упорядочивать непосредственно под эпидермальным слоем и стимулируют эпителий плакоды , чтобы сформировать волосы , которые начинают расти вниз ^6. Высоко пролиферирующие матричные клетки, расположенные в нижней части ВЧ,конверт эти мезенхимные клетки и образуют луковицы, в то время как внутренний слой начинает дифференцироваться в концентрических цилиндров , чтобы сформировать волос вала (HS) и окружающий внутреннюю оболочки корня (IRS) ^2,3.

В постнатальной жизни эпидермис кожи состоит из трех отделения: интерфолликулярной эпидермис (IFE), сальные железы (SG) и HF. В отличие от IFE и SG , которые находятся в постоянном состоянии гомеостаза, ВЧ представляет собой динамичный мини-орган , который претерпевает непрерывные циклы роста (анагена), уничтожение (катагена) и покоя (телоген) ^4,7. Волосяной фолликул стволовые клетки (HFSCs) , что топливо , этот вечный цикл, постоянно находиться в специализированной нише в пределах HF , известной как выпуклость ^4. Во время анагена в HFSCs выхода из выпуклость, следующие сигналы активации с DP, начинают пролиферировать и спускаемся вниз , таким образом , создавая длинный линейный след клеток , известных как внешней оболочки корня (ПРС) ^8-10. Матричные клетки, которыеокружают DP на базе ВЧ, быстро цикла и мигрировать вверх проходит терминальной дифференцировки , таким образом , генерирующее HS и IRS ¹⁰ (рисунок 1). Продолжительность анагена определяет длину волос и зависит от пролиферативного и дифференциации мощности матричных ячеек ^6. Когда HF входит катагена, транзитно-усилительных матричные клетки в колбы перестают размножаться, подвергаются апоптозу и регрессируют полностью, потянув DP вверх , пока он не достигнет , не задействуя часть ВЧ ^8,11. Во время этого втягивания ВЧ образует временную структуру, известную как эпителиальный нить, которая характерна для катагена, и содержит много апоптозных клеток. У мышей, катаген длится от 3-4 дней и высокосинхронной в первом цикле волос. Когда HF достигает телоген все HFSCs становятся в состоянии покоя. Отличительными этапы цикла HF также характеризуются изменением цвета кожи мыши вследствие мelanin производство. Изменения кожи от черного во время анагена до темно – серого цвета во время катагена до розового во время телогене ^6,7,12,13.

Рисунок 1: волосяной фолликул цикл. КВ состоит из постоянной верхней части и нижней постоянно ремоделирования, езда на велосипеде часть , которая претерпевает непрерывные циклы быстрого роста (анагена), уничтожение (катагена) и относительной фазы форсированном или покоя (телоген). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.

ГКС поддержание ВЧ первоначально были идентифицированы с использованием чейза экспериментов, с помощью меченного тритием тимидина, которые показали население медленно меток задействуя удерживающих клеток (LRC) , которые проживали в постоянной области HF чуть ниже SG ^14. Достижения в HFSCхарактеристика выявлено небольшое количество маркеров , которые могут быть использованы для идентификации и выделения конкретных SCs из HF ниши ^15. Возможно, лучший маркер для обогащения HFSCs является CD34, поверхностный маркер клеток также идентифицирован как кроветворной SC маркера в организме человека ^16. В пределах этой популяции CD34 ⁺ две различные группы населения также были выделены основаны на α6 экспрессии интегринов ^2. Другой маркер является кератин 15 (К15) , который экспрессируется на высоком уровне в области выпуклость, совместно локализуется с экспрессией CD34 и К15 промотор используется для ориентации и выделения HFSCs в трансгенных животных ^15,17-19. В последнее десятилетие несколько других различных популяций HFSCs и клеток – предшественников также сообщалось проживать в пределах HF ^17,20-27.

Еще интересной особенностью HFSCs является их вклад в ремонт кожи. При нормальных условиях HFSCs пополнения HF и не принимают участия в IFE гомеостаза. Хаувер, в ответ на язву эти клетки выйдут из SC ниши и помощь в заселив ФИИ ^9. Недавно мы показали , что у мышей удалены для проапоптотического дисплея гена Sept4 / ARTS повышенное количество CD34, K15 и Sox9 ⁺ HFSCs, которые демонстрируют устойчивость к апоптозу. HFSCs были выделены из Sept4 / ИСКУССТВ ^{– / –} спинные шкуры с использованием флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) и там было больше , чем в два раза больше числа CD34 ⁺ и K15 ⁺ HFSCs. Эти Sept4 / ARTS ^{– / –} HFSCs были расширены в пробирке и не только привели к более колоний , но также способны выдерживать более жесткие условия по сравнению с контрольной группой ^28.

В результате того , что повышенное количество HFSCs, Sept4 / ARTS ^{– / –} мышей значительно быстрее зажила в ответ на иссечение кожи травм. Поразительно, Sept4 / ARTS ^{– / –} мышей displayeда большое количество регенерированных HFs из раневого ложа, а также значительно меньшие шрамы. Кроме того, мыши , удаленные для XIAP (ингибитор Х-хромосомой апоптоза), биохимической мишени ИСКУССТВ, продемонстрировали ухудшение заживления ^28.

Наши результаты и работы, выполненные в других лабораториях, показали, что HFSCs служат идеальной моделью для изучения биологии и функции взрослых SCS. Здесь мы описываем методологию для обогащения и выделения HFSCs и эпидермальных кератиноцитов на основе экспрессии четырех маркеров: интегрин а6; интегрин β1; Sca-1 (маркер для кератиноцитов эпидермиса) и CD34. Подобное выделение K15 ⁺ HFSCs также может быть выполнена с использованием K15-GFP – репортер мыши ^19.

Protocol

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Министерства Израиля здравоохранения. Все животные были обработаны в соответствии с утвержденным протоколом институционального ухода ?…

Representative Results

Этот протокол подробно описывает обогащение и выделение двух типов популяций:. Балджа SCs и кератиноцитов эпидермиса Рисунок 2 иллюстрирует основные этапы протокола. Использование кожи удаляется из спинного задней части 8-недельных мышей, мы обогатили выпира?…

Discussion

Протокол , описанный здесь , хорошо установлена ​​для выделения HFSCs из кожи спины взрослых мышей , но может быть в равной степени применяется для выделения других групп населения в структуре ВЧ, на основе выбора маркеров ^{2,16,23,28,29.} Этот метод особенно преимущественный по сравнению ?…

Materials

Isoflurane	Primal Critical Care	66794-017-10
Carbon dioxide	–	–
Electro Shaver	Oster	Golden A5	Shaver from any other company could be used
70% ethanol	Gadot Lab	830000051	96% ehtanol diluted with distilled water
Dissection mat			Dissection tools from any provider can be used
Forceps	Dumont	11251-10	Foreceps from any other company could be used
Scissors	Dumont	14094-11	Scissors from any other company could be used
Needles/Pins	–	–
Scalpel	Albion	10	Ensure that the scalpel has a blunt end
Tissue culture dish 60mm x 15mm	Sigma-Aldrich	CLS430166
PBS	–		In-house PBS without Calcium and Magnesium
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-050-1A	Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly
Pipettes 10ml	Sigma-Aldrich	Corning, 4488
Ice	–	–
50 ml sterie centrifuge tubes	Minplast Ein-shemer	35050-43
70µM Cell strainer	Fisher	22362548
40µM Cell strainer	Fisher	22362549
Staining buffer	–
Centrifuge	Eppendorf 5804 R	5805 000.017
FACS tubes with Cell strainer caps	Falcon	352235
FACS tubes	Falcon	352063
Integrin β1	eBioscience	25-0291	1:400
Integrin α6	eBioscience	15-0495	1:600
Sca I	eBioscience	11-5981	1:200
CD34	eBioscience	9011-0349	1:300
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	50ng/ml
Dry Chelex	BioRad	142-2842
Beaker	Pyrex	–
Distilled H2O	–	–
Stir bar	–	–
NHCl	BioLab	1903059
Fetal bovine serum (FBS)	Beit Haemek Biological Industries	400718	FBS obtained from a different company can be used
1L glass bottle	Ilmabor	Boro 3.3
Bottle top filter	Autofil	1102-RLS