Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken
Summary
Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Abstract
Ondanks de vooruitgang in het begrijpen van het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) progressie, de vijf-jaarsoverleving blijft laag als gevolg van lokaal recidief en metastasen op afstand. Eén hypothese om dit te verklaren herhaling is de aanwezigheid van kanker-achtige cellen stamcellen (CSC) die inherent chemo- en radio-weerstandsvermogen. Om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is het noodzakelijk experimentele modellen die de effectiviteit van gerichte behandelingen te valideren en derhalve betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs hebben. Hiervoor presenteren we een protocol voor de isolatie van CSCs uit humane HNSCC cellijnen die is gebaseerd op de combinatie van twee opeenvolgende cellen sorteringen uitgevoerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). De eerste is gebaseerd op de eigenschap van CSCs tot overexpressie ATP-bindende cassette (ABC) transporter eiwitten en dus uitgesloten, onder andere vitale DNA kleurstoffen zoals Hoechst 33342. De cellen gesorteerd met thmethode wordt aangeduid als een "side population" (SP). Aangezien de SP cellen vormen een klein percentage (<5%) van de ouderlijke cellen, een groeifase is noodzakelijk om het aantal te verhogen voordat de tweede celsortering. Vervolgens maakt de selectie mogelijk van cellen die bezitten twee HNSCC stamcellen kenmerken namelijk hoog expressieniveau van het celoppervlak marker CD44 (CD44 hoog) en de overexpressie van aldehyde dehydrogenase (ALDH hoog). Aangezien het gebruik van een enkele marker talrijke beperkingen en valkuilen voor de isolatie van CSCs de combinatie van SP, zal CD44 en ALDH markers een nuttig instrument CSCs verdere analytische en functionele assays die levensvatbare cellen te isoleren verschaffen. De steel-achtige kenmerken van CSCs werd uiteindelijk bevestigd in vitro door de vorming van tumorispheres en de expressie van β-catenine.
Introduction
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is een veel voorkomende maligniteit wereldwijd en ondanks de vooruitgang in de huidige behandelingen, patiënten met een gevorderde ziekte hebben een slechte prognose. De overall 5 jaars overleving van de patiënt is ongeveer 30%, ondanks de combinatie van therapeutische benaderingen met inbegrip van de operatie, chemo-radiotherapie en doelgerichte therapieën. Recente studies attribuut lokaal recidief en metastasen op afstand voor het overleven van kanker stamcellen-achtige cellen (CSC) na therapieën tegen kanker 1. Er is een groeiend bewijs dat er cellen presenterende eigenschappen stamcellen (ongedifferentieerde status zelfvernieuwing en differentiatie capaciteiten en telomerase-activiteit) in verschillende vaste tumoren zoals borst-, hersenen, prostaat, long, colon, pancreas, lever en huid 2- 10. Echter, de oorsprong van CSCs blijft onduidelijk 11,12. Zij kunnen het gevolg zijn van de kwaadaardige transformatie van normale stamcellen 3,13 of dedifferentiatie van tumorcellen die CSCs-achtige functies 14,15 verwerven. Daarom is het begrijpen van onderscheidende trajecten met betrekking tot CSCs zal inzicht geven in de vroege diagnose en behandeling van resistente HNSCC.
Het is voorgesteld dat CSCs ook resistente fenotypen die standaard chemotherapie en radiotherapie ontwijken, waardoor tumorrecidief bezitten in vergelijking met het grootste deel van tumorcellen 16-19 en zijn gelokaliseerd in hypoxische niches 20. Talrijke factoren zijn voorgesteld om deze resistenties van CSCs, zoals neiging tot rust, versterkt DNA herstel, opwaarts gereguleerd celcyclus controlemechanismen en vrije radicalen 21 uitleggen. Bovendien hebben verschillende oncogene moleculaire pathways kan worden bepaald in CSCs 17 geactiveerd. Om kennis CSCs verdere doelgerichte therapie verbeteren moeten we betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs, vanwege de heterogeniteit van stamcellen gerelateerde merkers inverschillende vormen van kanker 22.
In HNSCC, stam-achtige tumor-initiërende cellen zijn geïsoleerd uit primaire tumoren van patiënten door het sorteren cellen die verschillende CSC biomarkers (zoals drugs transporters 23 expressie, CD44 hoog, laag CD133 CD24 hoog, c-Met + fenotype 10,24, 25, of ALDH hoge activiteit 26) of het kweken van de primaire tumor patiënt te squamospheres dat CSC eigenschappen te vormen. Toch is het aantal squamospheres dramatisch af na twee passages, waardoor een kleine steekproef voor verdere karakterisering bestudeert 27. Daarom is in vitro testen uitgaande van gevestigde cellijnen is een eenvoudiger oplossing voor experimenten te ontwerpen met het oog op de kennis van CSCs verbeteren.
Het doel van dit artikel is een werkwijze te CSCs van HNSCC cellijnen te isoleren middels Multiparametrische flowcytometrische analyse een voorstelnd celsortering. De expressie van CD44 gecorreleerd met verschillende eigenschappen, waaronder CSCs ALDH activiteit side population (SP) fenotype, sferoïde vorming vermogen en tumorigeniciteit worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren onderpopulatie CSCs. CD44, een celoppervlak glycoproteïne is betrokken bij celadhesie en migratie. CD44 is sterk uitgedrukt in vele solide tumoren CSCs 28, met inbegrip van hoofd- en halskanker modellen 29-31. Bovendien kan CD44 hoge cellen te genereren in vivo een heterogene tumor terwijl CD44 laag cellen kunnen niet 10. De SP test is gebaseerd op de differentiële potentie van cellen aan de Hoechst kleurstof 22 uitstromen via de ATP-bindende cassette (ABC) transporter familie van eiwitten tot overexpressie in de CSC membraan. Deze test omvat het gebruik van ABC transporter remmers zoals verapamil in controlemonsters. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is een intracellulair enzym dat betrokken is bij het omzetten van retinol RETinoic zuur tijdens de vroege stamcel differentiatie 25,26. Cellen die hoge ALDH activiteit vertonen stamcellen-achtige cel gedrag in HNSCC 26 en een zeer klein aantal van ALDH hoge cellen vertonen in staat zijn om tumoren te genereren in vivo 26,32.
De combinatie van deze merkers en eigenschappen werd met succes gebruikt door Bertrand e t al. De-resistentie in vitro pt in vivo van deze CSCs Photon en koolstof ionenstraling 19. De resultaten toonden duidelijk aan dat de combinatie van verschillende celmerkers en eigenschappen zijn selectiever voor nuttige studies op HNSCC CSC populaties dan één marker benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een betrouwbare werkwijze voor de succesvolle isolatie van CSCs van een bepaalde cellijn die voor andere HNSCC cellijnen. Geïsoleerde hoofd en nek CSCs zijn dan geschikt voor verdere moleculaire karakterisering in vitro en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen 19. Toch kunnen enkele wijzigingen worden getest, afhankelijk van de kant bevolking of het CD44 hoog / ALDH hoge percentages in de ouderlijke cellijn. Bijvoorbeeld, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |
Referências
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells — Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells — Normal stem cells ‘Jedi’ that went over to the ‘dark side.’. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma–derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. . Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
