בידוד ואפיון של ראש וצוואר קשקש Cell Carcinoma-אוכלוסיית מאפייני תאי גזע לאחר

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

למרות ההתקדמות בהבנת הראש קרצינומה תאים קשקשיים הצוואר (HNSCC) התקדמות, שיעור הישרדות של חמש שנים נותרה נמוכה בשל הישנות מקומית גרורות מרוחקות. השערה אחת להסביר הישנות זה היא הנוכחות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) שמציגים chemo- מובנה וסיכון-התנגדות רדיו. על מנת לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, יש צורך יש דגמים ניסיוניים המאמתים את היעילות של טיפולים ממוקדים ולכן יש שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS. לשם כך, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של CSCS שורות תאי HNSCC אדם מסתמך על השילוב של שני sortings תא הרצוף מבוצע על ידי תא מופעל קרינת מיון (FACS). האחת מבוססת על הנכס של CSCS כדי overexpress ATP-כריכה קלטת (ABC) חלבונים טרנספורטר ובכך לכלול, בין היתר, צבעים DNA חיוניים כגון Hoechst 33342. התאים מסודרים עם השיטה מזוהית בתור "אוכלוסייה בצד" (SP). כאשר תאי SP מהווים אחוז נמוך (<5%) של תאים הוריים, שלב הולך וגדל הוא הכרחי על מנת להגדיל את מספרם לפני מיון התא השני. השלב הבא מאפשר את הבחירה של תאים שיש להם שני מאפיינים של תאי גזע HNSCC אחרים כלומר רמת ביטוי גבוהה של הסמן על פני קרום התא CD44 (CD44 ^גבוה) ואת יתר ביטוי של דהידרוגנז אלדהיד (ALDH ^גבוהה). מאז שימוש סמן יחיד יש מגבלות רבות ואת חסרונות עבור הבידוד של CSCS, השילוב של SP, CD44 וסמני ALDH יספקו כלי שימושי כדי לבודד CSCS עבור מבחני אנליטית נוספים ופונקציונליים הדורשים תאי קיימא. המאפיינים דמוי גזע של CSCS שקיבל תוקף ולבסוף במבחנה כתוצאה מהיווצרותם של tumorispheres ואת הבעת-קטנין β.

Introduction

ראש תא צוואר קשקש קרצינומה (HNSCC) היא סרטן נפוץ ברחבי העולם ולמרות התקדמות טיפולים שוטפים, חולים עם מחלה מתקדמת בעלות פרוגנוזה נמוכה. שיעור ההישרדות של 5 שנים הכוללת של המטופל הוא סביב 30% למרות השילוב של גישות טיפוליות כוללים ניתוחים, כימותרפיה והקרנות-וממוקדים-טיפולים. מחקרים שנעשה לאחרונה מייחסים הישנות מקומיים גרורות מרוחקות להישרדות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) בעקבות טיפולים נגד סרטן ^1. יש עדויות מצטברות התומכים בקיומה של תאים מציגי המאפיינים תאי גזע (מעמד מובחן, יכולות התחדשות עצמית והבחנה, ופעילות טלומרז) בגידולים מוצקים שונים כולל סרטן השד, המוח, הערמונית, הריאות, המעי הגס, לבלב, כבד ועור ^{2- 10.} עם זאת, המקור של CSCS עדיין לא ברור ^11,12. הם עשויים לנבוע שינוי ממאיר של תאי גזע נורמליים ^3,13 או dedifferentiation של תאים סרטניים כי לרכוש תכונות CSCS דמוי ^14,15. לכן, הבנת מסלולים ייחודיים הנוגעים CSCS תספק תובנה אבחון מוקדם וטיפול של HNSCC עמיד.

הוצע כי CSCS גם בעלי פנוטיפים עמיד כי להתחמק כימותרפיה והקרנות סטנדרטיות, וכתוצאה מכך ישנות גידול לעומת חלק הארי של תאים סרטניים ^16-19 והם מקומיים לתוך היפוקסי נישות ^20. גורמים רבים הוצעו על מנת להסביר התנגדויות אלה של CSCS, כגון נטיית קפאון, תיקון DNA משופר, מנגנוני בקרת מחזור התא למעלה מוסדר, ו רדיקלים חופשיים הדחה ^21. יתר על כן, מספר מסלולים מולקולריים בשעור ניתן להפעיל באופן ספציפי CSCS ^17. על מנת לשפר את הידע של CSCS עבור טיפולים במיקוד, אנו זקוקים שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS, בשל ההטרוגניות של סמני תא הקשורות גזעסוגים שונים של סרטן ^22.

בשנת HNSCC, גזע דמוי תאי ייזום גידולים בודדו מגידולים מטופלים העיקרי ידי מיון תאי מבטאי סמני CSC שונים (כגון ביטוי מובילים בזרימת תרופת ^{23, גבוה} CD44, CD133 ^הנמוך CD24 ^גבוה, c-Met ⁺ פנוטיפ ^{10,24, 25,} או ALDH ^גבוהה פעילות ²⁶⁾ או לטפח גידול מטופל עיקרי ליצירת squamospheres בעלי תכונות CSC. אף על פי כן, מספר squamospheres פוחתת באופן דרמטי לאחר שני קטעים, ובכך לתת גודל מדגם קטן עבור אפיון נוסף שלומד ^27. לכן, מבחני חוץ גופייה החל שורות תאים ומבוססות הוא פתרון קל יותר לתכנן את ניסויים על מנת לשפר את הידע של CSCS.

מטרת מאמר זה היא להציע שיטה לבודד CSCS שורות תאים HNSCC באמצעות ניתוח תזרים cytometric multiparametricnd מיון התא. הביטוי של CD44 בקורלציה עם מספר מאפיינים CSCS כולל פעילות ALDH, אוכלוסייה סייד (SP) פנוטיפ, יכולת גיבוש אליפטית ו tumorigenicity משמשים לבודד ולאפיין תת-אוכלוסייה זו של CSCS. CD44, גליקופרוטאין על פני קרום התא, הוא מעורב הידבקות נדידת תאים. CD44 מבוטא בכמות גבוהה בגידולים רבים מוצק ²⁸ CSCS, כולל במודלים סרטן הראש והצוואר ^29-31. יתר על כן, תאים ^גבוהים CD44 יכולים ליצור in vivo גידול הטרוגנית בעוד תאים ^נמוכים CD44 יכול לא ^10. את assay SP מבוסס על פוטנציאל ההפרש של תאים בזרימה לצבוע Hoechst ²² דרך קלטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של חלבוני טרנספורטר overexpressed בתוך הממברנה CSC. assay זה כולל את השימוש של מעכבי טרנספורטר ABC כגון verapamil בדגימות שליטה. dehydrogenase אלדהיד (ALDH) הוא אנזים תאי כי הוא מעורב המרת רטינול RETחומצת inoic במהלך התמיינות תאי גזע מוקדם ^25,26. תאים להפגין התנהגות תאי גזע דמוי ניכרת פעילות ALDH הגבוה HNSCC ²⁶ ומספר מעט מאוד של תאים ^גבוהים ALDH מסוגלים ליצור גידולי in vivo ^26,32.

השילוב של סמנים ומאפיינים אלה שימש בהצלחה על ידי אל e t ברטרנד. ללמוד את ההתנגדות במבחנה ובחי של CSCS אלה פוטון יון פחמן קרינה ^19. התוצאות שלהם הראו בבירור כי השילוב של סמנים ומאפייני תאים שונים הם בררני יותר ללימודים שימושיים על אוכלוסיות HNSCC CSCS מאשר גישות חד סמן.

Protocol

נהלי כל החיה בוצעו בהתאם להנחיות מקומיות על טיפול בבעלי חיים. כל הפרטים של מחקר זה אושרו על ידי CECCAPP, ועדה האתיקה צרפתית. בחירת 1. של אוכלוסייה סייד (SP) על ידי Assay בזרימת דיי Hoechst <li style=";text-align:right;…

Representative Results

בידודו של CSCS שורות תאי HNSCC היה כרוך בשני מיון רצוף בגלל האחוז הנמוך מאוד של CSCS בקו התא ההורי. המיון הראשון התבסס על היכולת של CSCS להוציא לצבוע Hoechst בשל מובילים בזרימת תרופה. זה הביא רכישת 1-5% מכלל האוכלוסייה תא הכולל מסודרים (איור 1). במהלך מיון ת…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה עבור הבידוד המוצלח של CSCS משורת תאים ספציפית כי הוא ישים שורות תאי HNSCC אחרות. CSCS הראש והצוואר מבודד אז הם מתאימים לאפיון מולקולרי נוסף במבחנה ואימות פונקציונלית ידי השתלה בעכברי immunodeficient ^19. עם זאת, כמה שינויים יכול להיבדק בהתאם הא?…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–