Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

Published: June 14, 2016 doi: 10.3791/54005
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3, 2,3, 4, 2,3
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 4Cardiovascular Institute, Maine Medical Center

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكولات التعامل مع الحيوانات التي فاندربيلت المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC، البروتوكولات رقم م / 10/117 (الخنازير) وM / 10/219 (الفئران) والتي أجريت وفقا للمعايير AAALAC الدولية. تمت الموافقة على استخدام أنسجة القلب الإنسان يدخر جامعة فاندربيلت المركز الطبي IRB (البروتوكول رقم 100887).

1. عينة جمع وتخزين

  1. جعل الطازجة 4٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB) حل.
    تنبيه: غلوتارالدهيد هي سامة، وارتداء قفازات والعمل في غطاء الدخان.
    1. جعل حل 0.2 M الأسهم من الجريدة الرسمية، ودرجة الحموضة 7.4 باستخدام 21.8 ز نا 2 هبو 4 و 6.4 غ ناه 2 ص 4. الكم ساتيس (كيو إس) إلى 1000 مل درهم 2 O.
    2. إضافة 400 ميكرولتر من 50٪ غلوتارالدهيد إلى 2.5 مل من PB حل سهم و 2.1 مل درهم 2 O.
  2. تزج قطعة (لا يزيد حجمها عن 2 جم 2) من الأنسجة في حل غلوتارالدهيد 4٪. ملاحظة: يمكن أيضا قطع صغيرة يمكن استخدامها ولكن ينبغي أن تكون ذات حجم كاف (أي أقل من 5 مم 2) أن تصور بسهولة بالعين من أجل تسهيل خطوات لاحقة من البروتوكول.
  3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، ثم تخزينها إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية.

2. Decellularization من نسيج القلب

  1. جعل الطازجة 10٪ محلول هيدروكسيد الصوديوم المائي باستخدام 10 غرام حبيبات هيدروكسيد الصوديوم / 100 مل درهم 2 O.
    تنبيه: حلول هيدروكسيد الصوديوم هي تآكل ويمكن أن يسبب حروق القلويات، ارتداء القفازات.
  2. شطف الأنسجة في DH 2 O.
  3. احتضان في 10٪ محلول هيدروكسيد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 - 10 أيام (حتى التغيرات النسيجية من البني المحمر إلى من البيض أو أبيض).
  4. شطف في DH 2 O حتى تصبح الأنسجة شفافة.
  5. تزج الأنسجة في حمض التانيك 1٪ لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام 1 مل 5٪ محلول المخزون في 4 مل درهم 2 O.
    تنبيه: حمض التانيكهو مهيج قوي، وارتداء القفازات.
  6. شطف في DH 2 O بين عشية وضحاها.

3. المعاملة بالأوزميك وتجفيف الأنسجة القلب (في الدخان هود للسلامة)

  1. جعل حل 0.2 M الأسهم العازلة كاكوديلات الصوديوم باستخدام 21.4 غرام كاكوديلات الصوديوم، 10.0 غرام كلوريد الكالسيوم و 450 مل درهم 2 O. المزيج، ثم إضافة حمض الهيدروكلوريك حسب الحاجة لضبط درجة الحموضة إلى 7.4. كيو إس 500 مل مع DH 2 O.
    تنبيه: كاكوديلات الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك سامة، وارتداء قفازات والعمل في غطاء الدخان.
  2. جعل حل الأسهم 2٪ مائي من رباعي أكسيد الأوزميوم في غطاء الدخان للسلامة عن طريق إذابة 1 غرام رباعي أكسيد الأوزميوم وضوح الشمس في 50 مل درهم 2 O.
    تنبيه: رباعي أكسيد الأوزميوم يعتبر خطرا استنشاق شديد. تثبيت البخار من الأغشية المخاطية أو مقل العيون ممكن، وبالتالي التعامل فقط في غطاء الدخان مع قفازات. ينصح حارس البداية.
  3. شطف الأنسجة في 0.1 م العازلة كاكوديلات الصوديوم (خلط المحلول 1: 1 مع DH
  4. كرر الخطوة السابقة مرتين، ليصبح المجموع ثلاثة يشطف العازلة.
  5. تزج الأنسجة في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في 0.1 العازلة كاكوديلات M الصوديوم (مزيج كاكوديلات الأسهم الصوديوم والأسهم رباعي أكسيد الأوزميوم 1: 1) على محور دوار لمدة 1 ساعة.
  6. شطف الأنسجة في 0.1 م العازلة كاكوديلات الصوديوم 3 مرات لكل يوم المدورة 5 دقائق.
  7. شطف الأنسجة باستخدام تركيزات متزايدة من الايثانول (30٪، 50٪، 75٪، 85٪، 95٪، وأخيرا 100٪) لمدة 15 دقيقة لكل منهما على محور دوار.

4. المقطع العرضي تحضير السطح لوزارة شؤون المرأة

  1. نقل الأنسجة في الإيثانول بنسبة 100٪ على طبق بيتري الضحلة أيضا تحتوي على 100 الإيثانول٪.
  2. عقد اجتماعين شفرات الحلاقة الحادة جدا مثل أن الشقق من الجانبين على اتصال مع بعضها البعض وحواف القطع عبر لتشكيل الجانبين من مثلث متساوي الاضلاع فوق العينة. ولتحقيق ذلك، استخدام اليد اليسرى لوضع شفرة واحدة على أقصى الجانب الأيسر من العينة وقطع نحو اليسار. في نفس الوقت، واستخدام اليد اليمنى لوضع شفرة الثانية في أقصى اليسار من العينة، وشريحة اليمين. وبالتالي، سيتم تراجع ريش ضد بعضها البعض من اتجاهين متعاكسين لجعل خفض سلس واحد.
  3. حرك الجانبين شفرة مسطحة ضد بعضها البعض لاجراء خفض نظيفة جدا من العينة مع الحد الأدنى من التشويه أو تمزيق القوة، ويفضل تعريض الكبيرة ومساحة ممكنة دون الإضرار العينة.
  4. كرر لكل عينة لفضح أنظف الممكنة السطوح المقطع العرضي للفحص في وزارة شؤون المرأة.

5. الحرجة نقطة التجفيف (CPD) من أنسجة القلب

  1. استخدام ملعقة أو ملاقط لنقل الأنسجة لصاحب العينة من الحرج مجفف نقطة (CPD)، وضمان أن الأنسجة لا تزال في الإيثانول بنسبة 100٪ في جميع الأوقات. تأكد من أن حامل ومغمورة في الإيثانول وأن يتحقق نقل مع النسيج تعرضها للهواء لمدة لا تتجاوز بضع ثوان.
  2. تعمل وثيقة البرنامج القطري لكل منادليل إيه لإكمال 3 تطهير وملء دورات ليحل محل الايثانول مع ثاني أكسيد الكربون السائل.
  3. تعمل CPD في دليل المستخدم لتحقيق تجفيف نقطة حرجة من العينات وإعادتها إلى الضغط الجوي مع التنفيس تسيطر عليها CO 2.

6. تركيب عينات الأنسجة القلب لوزارة شؤون المرأة

  1. إعداد عينة كعب SEM لكل عينة، من خلال الالتزام علامة تبويب لاصق الكربون إلى السطح العلوي من كعب الألومنيوم.
  2. مع المعونة من مجهر تشريحي، والتمسك بعناية العينة إلى علامة التبويب لاصق مع قسم سطح عريض من الفائدة مواجهة (بعيدا عن علامة التبويب، مرئية)، وفي أقرب وقت ممكن موازية مع الطائرة من سطح العينة كعب. لا التحقيق أو لمس سطح الفائدة.
  3. كسر قضيب عصا خشبية لتحقيق فرشاة مدببة، مثالية لتطبيق الطلاء. تطبيق الفضة أو طلاء الكربون في قاعدة وجوانب من العينة، لتحسين الالتزام كعب.
  4. تمديد خط رفيع جدا من الفضة أو الكربون طلاء يصل إلى حافة السطح من الاهتمام، لتوفير مسار تهمة من سطح تهم الأرض.
  5. تطبيق 2 أو 3 اللمسات صغيرة من الفضة أو طلاء الكربون حول محيط علامة التبويب الكربون، لتوفير مسار موصل من سطح التبويب الكربون إلى كعب المعدن وبالتالي إلى الأرض.
  6. السماح الطلاء موصل لتجف لمدة ساعة.
  7. تعمل المغطى تفل في دليل المستخدم لتطبيق الطلاء الثقيلة نسبيا (النطاق المستهدف من 30 - 40 نانومتر) من سبائك الذهب والبلاديوم أو الذهب. ضخ غرفة العينة إلى ما يقرب من 0.1 مللي بار. مجموعة الموقت إلى 40 ثانية. فتح مجموعة صمام إلى (تدفق غاز الأرغون معتدل) 08:00 الموقف. اضغط على بدء لبدء طلاء بالرش في 30 مللي أمبير. يجب أن يكون التفريغ توهج الأرجواني مرئية في غرفة العينة.

7. SEM فحص عينات الأنسجة القلب

  1. أداء المجهر الإلكتروني في الجهد تسريع منخفضة نسبيا للحد من التصوير صroblems المرتبطة الفقراء تبديد المسؤول في العينة (شحن). اقترح حالة التصوير الأولي هي: 5 كيلو فولت يتسارع الجهد، 10 مم العمل عن بعد.
  2. مع مساعدة من عامل من ذوي الخبرة، وزيادة توظيف العمل عن بعد لتوسيع عمق الميدان في ظروف التصوير التي تحتاج إلى تركيز من الألياف في طائرات التنسيق متعددة، أو الألياف تمتد لطول كبير في البعد ض.
    1. لالاداة المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد)، في الوصول إلى واجهة المستخدم علامة التبويب الملاحة في الجزء العلوي الأيمن.
    2. الوصول إلى علامة التبويب الاحداثيات من القائمة المرحلة. لزيادة مسافة العمل، أدخل قيمة أكبر في ملليمتر لZ الإحداثي ثم انقر على الذهاب إلى علامة التبويب لتحريك مرحلة العينة إلى العمل عن بعد إدخالها.
  3. مع مساعدة من عامل من ذوي الخبرة، وتوظيف الميل العينة وتناوب على وضع سطح متعامد تهم شعاع الالكترون. الميل الإضافي من 10-30 degrالبيرينيه من هذا الموقف قد تحسين مراقبة وتوثيق هيكل المصفوفة.
    1. لالاداة المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد)، في واجهة المستخدم، انقر مع الاستمرار على زر الماوس الأيمن، ثم مرر اليسار أو اليمين للتركيز العينة بالقرب من المحيط الخارجي للطائرة سطح المعدة من الفائدة، مشيرا الى ان المسافة العمل المركزة .
    2. انتقل مع دليل واجهة المستخدم عصا التحكم لنقل بالقرب من حافة المتعارضة التركيز السطح وتكرار. إذا العمل عن بعد لا تساوي تقريبا إلى المركز الأول، عينة الميل للتوصل إلى اتفاق تقريبي في كلا الموقعين باستخدام علامة التبويب إحداثيات القائمة المرحلة (انظر 7.2) وإدخال قيمة الميل في تي تنسيق.
    3. تدوير العينة تسعين درجة (إدخال قيمة في الحقل R تنسيق)، وكرر العملية حتى تتركز كل المواقف تقريبا في المسافة العمل نفسها.
      ملاحظة: يمكن أن يستخدم ضغط متغير ووزارة شؤون المرأة لتحسين تهمة تبديدإذا كانت متوفرة. عالية الفراغ هو وضع التشغيل القياسية لالمجهر الإلكتروني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطبيق هذه التقنية المميزة لأنسجة القلب من غير المستخدمة زرع قلب الإنسان المانحة (الشكل 1)، الأنسجة explanted من متلقى، قلوب من النوع البري والفئران التصنع (الشكل 3)، وبعد عضلة القلب عينات احتشاء القلب من الخنازير نموذج من إصابة القلب (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل رقم 1، مصفوفة القلب البشرية هي نسج معقدة من البروتينات عبر ربط ذلك عرض نمط يشبه قرص العسل عند عرضها في المقطع العرضي. كل 'العسل' هيكل ما يقرب من 40 ميكرون واسعة، عادة التحايل على العضلية واحدة، عند النظر في عرض مستو في الشكل 1. وعند توصيله عن طريق أقراص مقحم، عدة العضلية يمكن أن يكون على النحو المتوخى قضيب تشغيل بالطول من خلال "النفق" عندما الاستعارة تم تمديده لثلاثة أبعاد. الشكل (1) أيضا يسلط الضوء على أهمية عملية القطع، مع مزيد من الدقة تدر البيانات الطبوغرافية أكثر الوحي (الشكل 1، أعلى اليسار) من المقاطع التي يتم "حطم" أثناء عملية التقطيع (الشكل 1، أعلى اليمين).

إزالة الخلايا المقيمة في القلب والأوعية الدموية، والخلايا في الدورة الدموية قبل معالجة SEM تكشف تفاصيل إضافية فائقة الهيكلية التي من شأنها أن تكون أقل ملموس من قبل SEM كتل أنسجة القلب كله. كل فرد كولاجيني "تبختر"، على سبيل المثال (الشكل 1، لوحات أسفل) على ما يبدو محاذاة على فترات منتظمة وعمودي على ييفة عضلية ساركومير. هذا الترتيب هو مناسبة لمساعدة الحفاظ على بنية القلب بتشوهات المفعول المضاد المبذولة خلال التقلص والاسترخاء دورات، على غرار "اللحمة والسداة" من المنسوجات التي تساعد على الحفاظ على الجسم النسيج والنموذج ضد التمدد.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: الممثل الضوئي الكترون الميكروسكوب لترتيب ثلاثي الأبعاد من مصفوفة خارج الخلية في Decellularized البطين الأيسر الأنسجة التي يتم الحصول عليها من القلب المانحة البشري غير المستخدمة تظهر اثنين من كبار وحات المصفوفة في المقطع العرضي في تضخم منخفضة (الحانات = 500 ميكرون)، توفير عرض جوي للبنية طبيعية أنسجة القلب الإنسان. في أعلى التكبير، ويمكن للمرء أن يلاحظ أفضل لهيكل يشبه قرص العسل نموذجية من الألياف الداعمة التي تقدم الدعم الميكانيكي للmyofibers متباعدة بصورة منتظمة (المتوسطة القضبان لوحة اليسار واليمين = 100 ميكرون و 50 ميكرون، على التوالي). على توثيق التفتيش، ويتكون كل "قرص العسل" من الألياف التي يتم تنظيمها بالتوازي مع واحد في حين آخر عمودي على العضلية المقيمين (الحانات أسفل لوحة اليسار واليمين = 10 ميكرون و 5 ميكرون، على التوالي).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالإضافة إلى توفير المعلومات الهيكلية، يمكن SEM الأنسجة decellularized تسمح، التقييم النوعي معنى التغيرات المصفوفة خارج الخلية في الاستجابة لإصابة أو أشكال غير الضارة من القلب. على سبيل المثال، استخدمت هذه التقنية في الآونة الأخيرة لدراسة المصفوفات خارج الخلية في مرحلة ما بعد محتشية أنسجة القلب الخنازير 43. خلال هذه التجربة والحيوان واسع، والمصممة خصيصا لتقييم فعالية الإسوي GGF2 من NRG-1β باعتباره العلاجية المحتملة لفشل القلب، والخنازير بعد محتشية التي تلقت إدارة NRG-1β الوريد معارضها ضرب تغييرات في مصفوفة القلب مقارنة مع أنسجة القلب غير المعالجة من الحيوانات بعد محتشية. وهذه النتائج نشرت في وقت لاحق 43، والشركة المصرية للاتصالاتظلت chnique أداة قيمة لبناء على هذا، واكتشاف سار الأولي الشكل 2 تشمل الميكروسكوب سبيل المثال، أنتجت خلال تلك الدراسة، التي تسلط الضوء على الاختلافات مصفوفة جذرية بين المصفوفات دون علاج وNRG-1β المعاملة.

الشكل 2
الشكل 2: الممثل الضوئي الكترون الميكروسكوب من البطين الأيسر خارج الخلية مصفوفة في الخنازير غير المعالجة وNRG-1 β المعالجة بالإثير، بعد هيدروكسيد الصوديوم تعطين المصفوفة في المقطع العرضي يسلط الضوء على الترتيب المكاني منتظم من الألياف في غير المعالجة احتشاء عضلة القلب بعد (آخر-MI) الخنازير (أعلى اليسار)، بالمقارنة مع الحيوانات بعد MI تعامل NRG-1β (أعلى اليمين). عندما ينظر إليها في الطول، مصفوفة في الخنازير غير المعالجة المعارض سميكة، مثل ماتي مظهر (أسفل اليسار)، في حين أن مصفوفة NRG-المعالجة 1β الخنازيريعرض الترتيب المكاني منتظم من الألياف (أسفل اليمين). شريط أبيض = 40 ميكرون (كل اللوحات الأربعة). وشملت النتائج والأرقام أكثر تفصيلا في المخطوطة المرتبطة 43. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد أسفر التنقيب عن التغييرات المصفوفة التي تحدث في قلوب التصنع أيضا رؤى النوعية في تطور وتطوير نموذج حيواني من دوشين العضلي القلب الضمور (DMD). في الفئران MDX، نموذج الفأر التي يشيع استخدامها من DMD، هناك اختلافات كبيرة وتعتمد على عمر بين من النوع البري وقلوب MDX عندما ينظر إليها من قبل وزارة شؤون المرأة بعد تثبيت والعلاج هيدروكسيد الصوديوم. كما هو مبين في الشكل (3)، وكانت مكونات المصفوفة العادية نسبيا في قلوب MDX القديمة أسابيع 6 تفتقر الدستروفين الوظيفية بالنسبة إلى الفئران العادية. أكثر كثافةeresting، تعطلت تنظيم المصفوفة خارج الخلية بشكل واضح أو ربما المتدهورة في الفئران الدستروفين نقص كبار السن مقارنة مع الفئران MDX الأصغر سنا، مما يدل على الطبيعة التقدمية للنائب العضو المنتدب في القلب. وليس من المتوقع هذه الاختلافات عميقة، لأن الفئران MDX هي ممثل سيئة من القلب DMD البشري يرجع ذلك إلى حقيقة أن هم يعرضون أكثر اعتدالا بكثير النمط الظاهري القلب ومعدل وفيات أبطأ من البشر مع DMD 48. وهذا يشير إلى أن التغيرات الصغيرة حتى في وظيفة القلب يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية التصور المعروضة في هذه المخطوطة. وينبغي أيضا أن تكون هذه المنهجية قابلية للتكيف مع مصفوفات خارج الخلية من الأجهزة الأخرى، والتي توجد أيضا أي المتاحة حاليا العلاجات التي تستهدف التليف.

الشكل (3)
الشكل (3): الممثل الضوئي الكترون الميكروسكوب من اليسار فينtricular خارج الخلية مصفوفة في البرية من نوع الفئران مقابل MDX. مصفوفة البطين الأيسر في القلب في البرية من نوع الفئران (أعلى لوحة) هي مماثلة لتلك التي لوحظت في الأنواع الأخرى. مصفوفة في الفئران MDX في 6 أسابيع من العمر تبدو عادية نسبيا، على الرغم من أن قليلا "رقيق" في المظهر (لوحة المتوسطة). على العكس، فإن مصفوفة القلب من الفئران MDX القديمة يبدو المتخلفة بشدة (اللوحة السفلية)، مشيرا إلى أن عملية التصنع يمكن التقاط نوعيا باستخدام ووزارة شؤون المرأة في والأنسجة الثابتة متآكلة هيدروكسيد الصوديوم. الأبيض شريط = 10 ميكرون (اللوحات الثلاث). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عبر إعداد قسم السطح هو الخطوة الأكثر أهمية خلال البروتوكول. للحفاظ على هيكل غرامة، ويجب أن تظل العينات المجففة في الإيثانول بنسبة 100٪ في جميع الأوقات حتى أدخلت على عملية التجفيف نقطة حرجة. وبالتالي فإن تشريح عينات لتحقيق يجب أن يتم السطوح لفحص EM بينما مغمور العينات في الايثانول في طبق ضحل. ومن الأهمية بمكان أيضا أن السطح المعرض لا مست أو سبر خلال معالجة لاحقة. ومن المتوقع إدخال أي تعديلات رئيسية لتطبيق هذه التقنية لأنواع الأنسجة الأخرى لملاحظات مصفوفة مماثلة، على الرغم من أن جزء SEM البروتوكول قد يتطلب الأساسي استكشاف الأخطاء وإصلاحها المجهر الإلكتروني بغض النظر عن أصل العينة. الصور التي تم جمعها من العينات ليفية عرضة للالتحف التي أدخلها تبديد سوء تهمة ( "فرض"). وعادة ما يمكن أن يكون الحد الأدنى مشاكل الشحن عن طريق الحد من تسارع الجهد، وزيادة سرعة المسح الضوئي (وتسمى أيضا زمن السكون) والحد من حجم بقعة شعاع الالكترون. دمج عدة بمسح جمع بسرعة كافية لتجنب القطع الأثرية تهمة سوف تنتج صورة من إشارة مماثلة لجودة الضوضاء دون القطع الأثرية تهمة الحالية في أبطأ، وأعلى جودة واحدة صورة المسح الضوئي.

هذا الأسلوب هو نوعية بطبيعتها وتكمل عند النظر إلى جانب القياسات الكمية (على سبيل المثال، ثلاثي الألوان ماسون أو picoserius تلطيخ أحمر، قياس محتوى هيدروكسي، مطياف الكتلة وRNASeq) للتأكد من مدى الاختلافات الهيكلية تصور قد تكون ذات صلة لمختلف الدول في النمو أو مرض هكذا. ومع ذلك، على الرغم من هذا القيد، فإن هذه الطريقة كبير وراء تليف القلب على وجه التحديد، لأن المصفوفة خارج الخلية هي عنصر أساسي في كل عضو تقريبا في الجسم. في القلب، وتقدم المصفوفة القلب الدعم الميكانيكية حاسم لالضخ المستمر يتميز مجمع تمتد والبرم، ومواطنهormation الوقود النووي، الذي يمنح دخول الأمثل وهروب رأس المال من المؤكسج وغير المؤكسج الدم 49 ل> 2.5 مليار يدق التي تحدث على مدى متوسط ​​عمر الإنسان. وبالنظر إلى منخفضة للغاية القدرة التجديدية للأنسجة القلب، ومصفوفة ديناميكية التي يمكن تشكيلها وفقا لاحتياجات السياق المنطقي منطقي. مع امتداد طفيف فقط من الخيال، يمكن للمرء أن يستنتج أن هناك وجود الأهداف العلاجية لمعالجة مصفوفة إعادة عرض لتعزيز عملية الشفاء، مع الحد من التليف سلبي. تطبيق تقنية أثبتت كحد أدنى يعرض التطور والجمال من مصفوفة القلب وبذلك أبعد يؤكد أهمية الوظيفية.

في حين بلغت قيمة التدابير الكمية هي المبدأ الأساسي لتقييم جميع الدراسات التجريبية عمليا، وتقنية أبرز هنا يمكن أن تستخدم للكشف عن الاختلافات التركيبية النوعية التي تكمل ليس فقط القياسات مصفوفة قياسيةولكن قد توحي مسارات التحقيق بديلة لفهم التغيرات البيوكيميائية الأساسية التي تؤكد التغيرات النوعية. التطبيقات المتوقعة في المستقبل من هذه التقنية هي استخدامها في نماذج مرض القلب والأنسجة البشرية كأداة مكملة لتقييم التغيرات مصفوفة، وكذلك استخدام سعت لدراسة الأجهزة الأخرى التي التغييرات المصفوفة هي عنصر من عناصر عملية المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium Chloride Electron Microscopy Sciences 12340 100 g
Carbon Adhesive Electron Microscopy Sciences 12664 30 g
Carbon Adhesive Tabs Electron Microscopy Sciences 77825 order to fit stubs
Double Edge Razor Blades Stainless Steel Ted Pella, Inc 121-6 250/pkg
Ethanol Electron Microscopy Sciences 15055 450 ml
Gluteraldehyde, 50% Solution Electron Microscopy Sciences 16310 EM grade, distillation purified
Hydrochloric Acid Electron Microscopy Sciences 16760 or 16770 100 ml
Monosodium Phosphate NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9251-250G 250 g
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 1 g
Silver Conductive Adhesive Electron Microscopy Sciences 12686-15 15 g
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045-1KG 1 kg
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264-500G 500 g
Tannic Acid, 5% Aqueous  Electron Microscopy Sciences 21702-5 500 ml
Trihydrate Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 100 g
Gold-palladium Alloy or Gold Refining Systems, Inc.  varies specific to the sputter coater make and model
Critical Point Dryer Electron Microscopy Sciences 850
Plain Wooden Applicators Fisher Scientific 23-400-102
Quanta 250 Environmental SEM FEI Q250 SEM
Sputter Coater Cressington Scientific Instruments Ltd. Model 108
Alluminum SEM Sample Stubs Electron Microscopy Sciences 75220-12 specific to the miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
  2. Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
  3. Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
  4. Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
  5. Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
  6. Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
  7. Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
  8. Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
  9. Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
  10. Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
  11. Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
  12. Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
  13. Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
  14. Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
  15. Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
  16. Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
  17. Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
  18. Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
  19. Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
  20. Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
  21. Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
  22. Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
  23. Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
  24. Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
  25. Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
  26. Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
  27. de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
  28. Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
  29. Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
  30. Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
  31. Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
  32. Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
  33. Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
  34. Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
  35. Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
  36. Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
  37. Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
  38. O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
  39. Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
  40. Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
  41. Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
  42. Finsterer, J., Stollberger, C. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  43. Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773 (2014).
  44. Caulfield, J. B., Borg, T. K. The collagen network of the heart. Lab Invest. 40, 364-372 (1979).
  45. Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
  46. Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
  47. Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
  48. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
  49. Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).

Tags

بروتوكول الأساسي، العدد 112، المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، القلب، المصفوفة خارج الخلية، والتليف، decellularization، تليف القلب، هيدروكسيد الصوديوم النقع
المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stephenson, M. K., Lenihan, S.,… More

Stephenson, M. K., Lenihan, S., Covarrubias, R., Huttinger, R. M., Gumina, R. J., Sawyer, D. B., Galindo, C. L. Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (112), e54005, doi:10.3791/54005 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter