This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Dyrkede cardiomyocytter kan anvendes til at studere cardiomyocyte biologi anvendelse af teknikker, der er komplementære til in vivo-systemer. For eksempel, renhed og tilgængeligheden af in vitro-dyrkning giver fin kontrol over biokemiske analyser, levende billedbehandling og elektrofysiologi. Langsigtet kultur af cardiomyocytter giver adgang til yderligere eksperimentelle metoder, som ikke kan gennemføres i kortsigtede kulturer. For eksempel in vitro undersøgelse af dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledelingen har hidtil stort set været begrænset til rottecardiomyocytter, som synes at være mere robust i langsigtet kultur. Imidlertid er tilgængeligheden af en rig værktøjssæt af transgene mus linjer og veludviklede sygdomsmodeller gør muse systemer attraktive for kardial forskning. Selv om flere rapporter findes i voksne mus cardiomyocyte isolation, få undersøgelser viser deres langsigtede kultur. Præsenteret her er en trin-for-trin metode tilisolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. Først retrograd Langendorff-perfusion bruges til effektivt fordøje hjerte med proteaser, efterfulgt af gravitationssedimentation oprensning. Efter en periode med dedifferentiering efter isolering, cellerne gradvist vedhæfte til kulturen, og kan dyrkes i ugevis. Adenovirus cellelysat bruges til effektivt at transducere de isolerede cardiomyocytter. Disse metoder giver en enkel, men kraftfuld model-system til at studere hjerte-biologi.
Dyrkede cardiomyocytter anvendes hyppigt til at overvåge celle adfærd i en velkontrolleret miljø in vitro. For eksempel kan morfologiske, elektriske, biokemiske, eller mekaniske celleegenskaber studeres på manipuleret substrater, 1,2 i definerede medier, og som reaktion på lægemidler med små molekyler, peptider, genregulering, 3 eller elektrisk stimulation. 4 cellulære indhold kan også styres ved hjælp af definerede co-kulturer. 5 Disse in vitro-forsøg er nyttige i store stof eller genetiske skærme og supplere in vivo-metoder for forskellige typer af undersøgelser, der involverer cardiomyocyte biologi.
Langsigtet kultur muliggør eksperimentelle muligheder, der kræver længere tid til at opnå fænotypisk forandring. En rettidig eksempel er voksne pattedyr cardiomyocyte spredning, hvor dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledeling typisk undersøgt over seVeral dage til uger. 6,7 Her den forlængede kultur tiden letter genetisk manipulation, 7,8 funktionel dedifferentiering (f.eks sarcomerisk demontering) 9 og potentielt transkriptionel dedifferentiering. 6 Efterfølgende cellecyklus genindrejse og celledeling kræver endnu længere kultur perioder at observere, især hvis flere runder af division er den eksperimentelle mål. Betydningen af cardiomyocyte celle-cyklus er centralt for flere nylige centrale videnskabelige værker i hjertet regenerering, hvor dedifferentieringen og proliferation af allerede eksisterende cardiomyocytter er blevet vist ansvarlig for hjerte regenerering i zebrafisk og neonatale mus. 10-12 Således muligheden at stimulere dedifferentiering og cellecyklus genindrejse i mammale voksne cardiomyocytter er fortsat et centralt spørgsmål i menneskets hjerte regenerering 13-15
I n vitro forsøg studerer cellecyklussen fra pattedyr cardiomyocytter har hovedsagelig anvendes rotte kilder på grund af deres relativt lette langtidsdyrkning sammenlignet med musemodeller. 16 imidlertid murine systemer tilbyder en rig ressource af velkarakteriserede transgene værktøjer og sygdomsmodeller, som er nyttige i både in vitro og in vivo protokoller. For eksempel har Cre-baserede afstamning sporing muliggjort identifikation af allerede eksisterende cardiomyocytter som en kilde til at regenerere myocardium i neonatale mus hjerte in vivo. 12 In vitro-undersøgelser af afstamning-sporet neonatale mus cardiomyocytter har aktiveret undersøgelse af interaktioner med stromale celler gennem co-kultur med fibroblaster. 5 Men på grund af dets udfordringer, eksisterer 17 få rapporter af isolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. 18,19
Isoleringen af levedygtige voksne mus cardiomyocytter til kortvarig kultur alene er kendt for at være en udfordrende opgave. Denne protocol giver trin-for-trin instruktioner om, hvordan man opnår levedygtige cardiomyocytter fra voksne mus, der kan bruges til både kortsigtede såvel som langsigtede undersøgelser. Cardiomyocytter isolerede ved hjælp af denne protokol kan effektivt transduceres med adenovirusvektorer 20,21 og dyrket i ugevis. Disse metoder giver et kraftfuldt system til at studere cardiomyocyte biologi in vitro.
De heri beskrevne metoder er baseret på en række elementer fra tidligere værker ved hjælp variationer af Langendorff retrograd perfusion. 18,22 Selvom flere protokoller er blevet offentliggjort på isolering af voksne mus cardiomyocytter for kortsigtet kultur og undersøgelse, 23-25 den fordel, denne protokol er evnen til at dyrke isolerede cardiomyocytter lang sigt. Dette vil være nyttigt i studiet af cellulære processer, der involverer ektopisk genekspression og kræver længere perioder, såsom i cellulære omprogrammering strategier.
Den generelle sundhed af de isolerede cardiomyocytter afhænger af flere vigtige aspekter af denne protokol. Første, tiden fra hjertet ekstraktion til perfusion er kritisk og bør udføres i 5 min eller mindre. Fjernelse af calcium hjælper til at dissociere celle-celle-interaktioner, men kan have en negativ indvirkning celle sundhed langsigtet. 29-32 Således finder vi det tilstrækkeligt at fjerne calcium under de første par minutter af perfusion af EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) chelatering, 2…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af UCSF Program for Gennembrud Biomedical Research (finansieret delvist af Sandler Foundation), NIH Pathway til Independence Award (R00HL114738) og Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ blev understøttet af en postdoc stipendium fra NIH (T32HL007731). Forfatterne er alene ansvarlig for indholdet af dette arbejde, som ikke nødvendigvis repræsenterer officielle synspunkter NIH.
Equipment | |||
Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
NaCl | Sigma | S9888 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
Taurine | Sigma | 86329 | |
Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
HEPES | Fisher | BP310100 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
EGTA | Amresco | 0732-288 | |
Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
MEM | Corning | 15-010-CV | |
FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
Lab tape | VWR | 89097-990 | |
Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |