Isolation, Kultur og transduktion af Voksen Mouse cardiomyocytter
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Dyrkede cardiomyocytter kan anvendes til at studere cardiomyocyte biologi anvendelse af teknikker, der er komplementære til in vivo-systemer. For eksempel, renhed og tilgængeligheden af in vitro-dyrkning giver fin kontrol over biokemiske analyser, levende billedbehandling og elektrofysiologi. Langsigtet kultur af cardiomyocytter giver adgang til yderligere eksperimentelle metoder, som ikke kan gennemføres i kortsigtede kulturer. For eksempel in vitro undersøgelse af dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledelingen har hidtil stort set været begrænset til rottecardiomyocytter, som synes at være mere robust i langsigtet kultur. Imidlertid er tilgængeligheden af en rig værktøjssæt af transgene mus linjer og veludviklede sygdomsmodeller gør muse systemer attraktive for kardial forskning. Selv om flere rapporter findes i voksne mus cardiomyocyte isolation, få undersøgelser viser deres langsigtede kultur. Præsenteret her er en trin-for-trin metode tilisolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. Først retrograd Langendorff-perfusion bruges til effektivt fordøje hjerte med proteaser, efterfulgt af gravitationssedimentation oprensning. Efter en periode med dedifferentiering efter isolering, cellerne gradvist vedhæfte til kulturen, og kan dyrkes i ugevis. Adenovirus cellelysat bruges til effektivt at transducere de isolerede cardiomyocytter. Disse metoder giver en enkel, men kraftfuld model-system til at studere hjerte-biologi.
Introduction
Dyrkede cardiomyocytter anvendes hyppigt til at overvåge celle adfærd i en velkontrolleret miljø in vitro. For eksempel kan morfologiske, elektriske, biokemiske, eller mekaniske celleegenskaber studeres på manipuleret substrater, 1,2 i definerede medier, og som reaktion på lægemidler med små molekyler, peptider, genregulering, 3 eller elektrisk stimulation. 4 cellulære indhold kan også styres ved hjælp af definerede co-kulturer. 5 Disse in vitro-forsøg er nyttige i store stof eller genetiske skærme og supplere in vivo-metoder for forskellige typer af undersøgelser, der involverer cardiomyocyte biologi.
Langsigtet kultur muliggør eksperimentelle muligheder, der kræver længere tid til at opnå fænotypisk forandring. En rettidig eksempel er voksne pattedyr cardiomyocyte spredning, hvor dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledeling typisk undersøgt over seVeral dage til uger. 6,7 Her den forlængede kultur tiden letter genetisk manipulation, 7,8 funktionel dedifferentiering (f.eks sarcomerisk demontering) 9 og potentielt transkriptionel dedifferentiering. 6 Efterfølgende cellecyklus genindrejse og celledeling kræver endnu længere kultur perioder at observere, især hvis flere runder af division er den eksperimentelle mål. Betydningen af cardiomyocyte celle-cyklus er centralt for flere nylige centrale videnskabelige værker i hjertet regenerering, hvor dedifferentieringen og proliferation af allerede eksisterende cardiomyocytter er blevet vist ansvarlig for hjerte regenerering i zebrafisk og neonatale mus. 10-12 Således muligheden at stimulere dedifferentiering og cellecyklus genindrejse i mammale voksne cardiomyocytter er fortsat et centralt spørgsmål i menneskets hjerte regenerering 13-15
I n vitro forsøg studerer cellecyklussen fra pattedyr cardiomyocytter har hovedsagelig anvendes rotte kilder på grund af deres relativt lette langtidsdyrkning sammenlignet med musemodeller. 16 imidlertid murine systemer tilbyder en rig ressource af velkarakteriserede transgene værktøjer og sygdomsmodeller, som er nyttige i både in vitro og in vivo protokoller. For eksempel har Cre-baserede afstamning sporing muliggjort identifikation af allerede eksisterende cardiomyocytter som en kilde til at regenerere myocardium i neonatale mus hjerte in vivo. 12 In vitro-undersøgelser af afstamning-sporet neonatale mus cardiomyocytter har aktiveret undersøgelse af interaktioner med stromale celler gennem co-kultur med fibroblaster. 5 Men på grund af dets udfordringer, eksisterer 17 få rapporter af isolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. 18,19
Isoleringen af levedygtige voksne mus cardiomyocytter til kortvarig kultur alene er kendt for at være en udfordrende opgave. Denne protocol giver trin-for-trin instruktioner om, hvordan man opnår levedygtige cardiomyocytter fra voksne mus, der kan bruges til både kortsigtede såvel som langsigtede undersøgelser. Cardiomyocytter isolerede ved hjælp af denne protokol kan effektivt transduceres med adenovirusvektorer 20,21 og dyrket i ugevis. Disse metoder giver et kraftfuldt system til at studere cardiomyocyte biologi in vitro.
De heri beskrevne metoder er baseret på en række elementer fra tidligere værker ved hjælp variationer af Langendorff retrograd perfusion. 18,22 Selvom flere protokoller er blevet offentliggjort på isolering af voksne mus cardiomyocytter for kortsigtet kultur og undersøgelse, 23-25 den fordel, denne protokol er evnen til at dyrke isolerede cardiomyocytter lang sigt. Dette vil være nyttigt i studiet af cellulære processer, der involverer ektopisk genekspression og kræver længere perioder, såsom i cellulære omprogrammering strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den generelle sundhed af de isolerede cardiomyocytter afhænger af flere vigtige aspekter af denne protokol. Første, tiden fra hjertet ekstraktion til perfusion er kritisk og bør udføres i 5 min eller mindre. Fjernelse af calcium hjælper til at dissociere celle-celle-interaktioner, men kan have en negativ indvirkning celle sundhed langsigtet. 29-32 Således finder vi det tilstrækkeligt at fjerne calcium under de første par minutter af perfusion af EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) chelatering, 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af UCSF Program for Gennembrud Biomedical Research (finansieret delvist af Sandler Foundation), NIH Pathway til Independence Award (R00HL114738) og Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ blev understøttet af en postdoc stipendium fra NIH (T32HL007731). Forfatterne er alene ansvarlig for indholdet af dette arbejde, som ikke nødvendigvis repræsenterer officielle synspunkter NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
