Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Kultivierten Kardiomyozyten können verwendet werden , cardiomyocyte biology studieren Techniken , die zur in vivo – Systeme ergänzen. So ermöglicht beispielsweise die Reinheit und Zugänglichkeit der in vitro Kultur feine Kontrolle über biochemische Analysen, Echtzeit- Bildgebung und Elektrophysiologie. Langzeitkultur von Kardiomyozyten bietet Zugang zu zusätzlichen experimentellen Ansätzen, die in kurzen Zeitkulturen werden nicht abgeschlossen. Beispielsweise die in vitro Untersuchung der Entdifferenzierung, Zellzyklus – Wiedereintritt und die Zellteilung bisher weitgehend auf Ratten – Kardiomyozyten beschränkt, die in Langzeitkultur robuster zu sein scheinen. Allerdings machen die Verfügbarkeit einer umfassenden Werkzeugpalette von transgenen Mauslinien und gut entwickelten Krankheitsmodelle Maus Systeme attraktiv für Herzforschung. Obwohl mehrere Berichte von Kardiomyozyten Isolation erwachsenen Maus vorhanden sind, zeigen einige Studien ihre langfristige Kultur. Der hier präsentierte, ist ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für dieIsolation und langfristige Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten. Zunächst wird retrograden Langendorff-Perfusion verwendet effizient das Herz mit Proteasen zu verdauen, durch die Schwerkraft Sedimentation Reinigung gefolgt. Nach einer Zeit der Entdifferenzierung nach der Isolierung haften die Zellen allmählich auf die Kultur und für Wochen kultiviert werden. Adenovirus Zelllysat wird verwendet, um effizient die isolierten Cardiomyocyten transduzieren. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsfähige Modellsystem Herz Biologie zu studieren.
Introduction
Kultivierten Kardiomyozyten werden häufig zur Überwachung des Zellverhaltens in einer gut kontrollierten Umgebung in vitro verwendet. Beispielsweise morphologischen, elektrischen, biochemischer oder mechanische Zelleigenschaften auf Substraten konstruiert, 1,2 in definierten Medien, und in Reaktion auf niedermolekularer Wirkstoffe, Peptide, Genregulation, 3 oder elektrische Stimulation untersucht. 4 Die zelluläre Inhalt kann auch definiert Kokulturen gesteuert werden. 5 Diese in vitro – Experimente in großem Medikament oder genetischen Screens nützlich sind , und in vivo – Verfahren für verschiedene Arten von Untersuchungen ergänzen cardiomyocyte biology beteiligt sind .
Die langfristige Kultur ermöglicht experimentelle Wege, die Zeit erfordert ein erweitertes phänotypische Veränderungen zu erreichen. Ein aktuelles Beispiel ist die von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten Proliferation, wo Entdifferenzierung, Zellzyklus-Wiedereintritt und die Zellteilung wird in der Regel untersucht über seVeral Tage bis Wochen. 6,7 Hier erleichtert die erweiterte Kulturzeit genetische Manipulation, 7,8 funktionellen Entdifferenzierung (zB sarcomeric Demontage) 9 und möglicherweise Transkriptions Entdifferenzierung. 6 Nachfolgende Zellzyklus Wiedereintritt und die Zellteilung benötigt noch längere Kulturzeiten , vor allem, wenn mehrere Runden der Division sind die experimentellen Ziel zu beobachten. Die Bedeutung der Kardiomyozyten Zellzyklus ist von zentraler Bedeutung für mehrere aktuelle Schlüssel wissenschaftlichen Arbeiten in Herzregeneration, wo der Entdifferenzierung und Proliferation von bereits bestehenden Kardiomyozyten hat für Herzregeneration in Zebrabärbling und neugeborenen Mäusen verantwortlich gezeigt. 10-12 Somit ist die Möglichkeit , Entdifferenzierung und Zellzyklus – Wiedereintritt in Säuger adulten Kardiomyozyten bleibt eine zentrale Frage in der menschlichen Herzregeneration zu stimulieren 13-15
I n – vitro – Experimente in den Zellzyklus von Säugetier-Cardio – StudiumMyocyten haben überwiegend Rattenquellen verwendet, die aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit der Langzeitkultur im Vergleich zu Mausmodellen. 16 jedoch murinen Systemen eine reiche Quelle von gut charakterisierten transgenen Werkzeuge und Krankheitsmodelle bieten, die sowohl in in vitro und in vivo nützlich sind , Protokolle. Beispielsweise Cre-basierten lineage Verfolgung hat die Identifizierung von vorbestehenden Kardiomyozyten als Quelle von regenerierenden Myokard in der neonatalen Mäuseherzen in vivo aktiviert. 12 In – vitro – Studien von Lineage-verfolgt neonatalen Maus Kardiomyozyten aktiviert haben die Untersuchung von Wechselwirkungen mit stromal Zellen durch Kokultur mit Fibroblasten. 5 jedoch aufgrund seiner Herausforderungen bestehen 17 wenige Berichte über die Isolierung und die langfristige Kultur von erwachsenen Maus Kardiomyozyten. 18,19
Die Isolierung von lebensfähigen adulten Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur allein bekannt ist eine herausfordernde Aufgabe. Diese Protocol liefert eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie rentabel Kardiomyozyten von erwachsenen Mäusen zu erreichen, die für sowohl kurzfristige als auch langfristige Untersuchungen verwendet werden kann. Kardiomyozyten mit diesem Protokoll isoliert effizient mit adenoviralen Vektoren 20,21 und kultiviert Wochen transduziert werden. Diese Methoden stellen ein leistungsfähiges System Kardiomyozyten Biologie in vitro zu studieren.
Die hier beschriebenen Verfahren basieren auf mehreren Elementen aus früheren Arbeiten Variationen der Langendorff – Perfusion unter Verwendung von retrograden. 18,22 Obwohl mehrere Protokolle auf der Isolierung von erwachsenen Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur und Studie 23-25 der Vorteil veröffentlicht Dieses Protokoll ist die Fähigkeit, die isolierte Kardiomyozyten langfristig Kultur. Dies wird bei der Untersuchung von zellulären Prozessen beteiligt ektopische Genexpression und erfordern längere Zeit, beispielsweise in zellularen Umprogrammierung Strategien nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der allgemeine Gesundheitszustand der isolierten Kardiomyozyten, hängt von mehreren wichtigen Aspekten dieses Protokolls. Erstens ist die Zeit, von der Herz Extraktion Perfusion kritisch und sollte in 5 min oder weniger durchgeführt werden. Entfernung von Calcium hilft Wechselwirkungen Zell-Zell – zu dissoziieren, aber kann sich negativ auf die Gesundheit Zelllangzeitwirkung. 29-32 Somit finden wir es ausreichend durch EGTA (Ethylenglykol – tetraessigsäure) Chelatbildung Calcium während der ersten paar Mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde für Durchbruch biomedizinische Forschung von der UCSF-Programm finanziert werden (finanziert zum Teil von der Sandler-Stiftung), der NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) und der Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ wurde durch ein Postdoc-Stipendium von der NIH (T32HL007731) unterstützt. Die Autoren sind allein verantwortlich für den Inhalt dieser Arbeit, die nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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