L'isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Cardiomyocytes cultivés peuvent être utilisées pour étudier la biologie des cardiomyocytes en utilisant des techniques qui sont complémentaires des systèmes in vivo. Par exemple, la pureté et l' accessibilité de la culture in vitro permet un contrôle précis sur les analyses biochimiques, l' imagerie en direct, et l' électrophysiologie. la culture à long terme des cardiomyocytes offre un accès à des approches expérimentales supplémentaires qui ne peuvent être accomplies dans les cultures à court terme. Par exemple, l'enquête in vitro de dédifférenciation, cycle cellulaire rentrée, et la division cellulaire a jusqu'ici été largement limitée à des cardiomyocytes de rat, qui semblent être plus robuste dans la culture à long terme. Cependant, la disponibilité d'un riche ensemble d'outils de lignées de souris transgéniques et des modèles de maladies bien développés rendre les systèmes de souris attrayant pour la recherche cardiaque. Bien que plusieurs rapports existent d'isolement des cardiomyocytes de souris adulte, peu d'études démontrent leur culture à long terme. Présenté ici, est une méthode étape par étape pour lel'isolement et la culture à long terme des cardiomyocytes de souris adultes. Tout d'abord, rétrograde perfusion Langendorff est utilisé pour digérer efficacement le cœur avec des protéases, suivie d'une purification gravité de sédimentation. Après une période de dédifférenciation isolement suivant, les cellules se fixent peu à peu à la culture et peuvent être cultivées pendant des semaines. lysat cellulaire adenovirus est utilisé pour transduire efficacement les cardiomyocytes isolés. Ces méthodes fournissent un système de modèle simple, mais puissant pour étudier la biologie cardiaque.
Introduction
Cardiomyocytes Cultured sont fréquemment utilisés pour surveiller le comportement des cellules dans un environnement bien contrôlé in vitro. Par exemple, les propriétés morphologiques, électriques, biochimiques ou mécaniques cellules peuvent être étudiés sur des substrats modifiés, le 1,2 dans des milieux définis, et en réponse aux médicaments à petites molécules, des peptides, la régulation des gènes, 3 ou une stimulation électrique. 4 Le contenu cellulaire peut également être contrôlés à l' aide de co-cultures définies. 5 Ces expériences in vitro sont utiles dans un grand médicament ou écrans génétiques et complètent les méthodes in vivo pour divers types d'enquêtes portant sur des cardiomyocytes biologie.
la culture à long terme permet avenues expérimentales qui nécessitent des périodes de temps prolongées pour obtenir un changement phénotypique. Un exemple approprié est celui de la prolifération des cardiomyocytes adultes chez les mammifères, où la dédifférenciation, le cycle cellulaire rentrée, et la division cellulaire est typiquement étudiées sur soijours veral à quelques semaines. 6,7 Ici, le temps de culture étendue facilite la manipulation génétique, 7,8 dédifférenciation fonctionnelle (par exemple, le démontage sarcomère) 9 et dédifférenciation potentiellement transcriptionnelle. 6 Après cycle cellulaire ré-entrée et la division cellulaire nécessite des périodes de culture encore plus longues d'observer, en particulier si plusieurs cycles de division sont le but expérimental. L'importance de la cellule-cycle de cardiomyocytes est au cœur de plusieurs ouvrages scientifiques clés récents dans la régénération du cœur, où la dédifférenciation et la prolifération des cardiomyocytes préexistantes a été montré responsable de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre et la souris néonatales. 10-12 Ainsi, la possibilité pour stimuler la dédifférenciation et cycle cellulaire ré-entrée dans les cardiomyocytes adultes de mammifères reste une question clé dans la régénération du cœur humain 13-15
I n expériences in vitro l' étude du cycle cellulaire chez les mammifères des maladies cardiomyocytes ont principalement utilisé des sources de rat, en raison de leur relative facilité de culture à long terme par rapport aux modèles de souris. 16 Cependant, les systèmes murins offrent une riche source d'outils transgéniques bien caractérisés et des modèles de maladies qui sont utiles à la fois in vitro et in vivo , protocoles. Par exemple, le traçage de la lignée à base de Cre a permis l'identification des cardiomyocytes préexistantes comme une source de régénération du myocarde dans le coeur de la souris néonatale in vivo. 12 Les études in vitro de cardiomyocytes de souris néonatales lignagères tracé ont permis l'examen des interactions avec stromal cellules par le biais de co-culture avec des fibroblastes. 5 Cependant, en raison de ses défis, 17 quelques rapports existent de l'isolement et à long terme la culture de cardiomyocytes de souris adultes 18,19.
L'isolement des cardiomyocytes de souris adultes viables pour la culture à court terme seul est connu pour être une tâche difficile. Cette protocol fournit étape par étape les instructions sur la façon d'atteindre cardiomyocytes viables de souris adultes qui peuvent être utilisés à la fois à court terme, ainsi que des enquêtes à long terme. Cardiomyocytes isolés en utilisant ce protocole peuvent être efficacement transduites avec des vecteurs adénoviraux 20,21 et cultivés pendant des semaines. Ces méthodes fournissent un système puissant pour étudier la biologie des cardiomyocytes in vitro.
Les procédés décrits ici sont basés sur plusieurs éléments de travaux antérieurs utilisant des variations de la perfusion rétrograde Langendorff. 18,22 Bien que plusieurs protocoles ont été publiés sur l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes pour la culture à court terme et à l' étude, l'avantage de 23-25 ce protocole est la capacité de la culture des cardiomyocytes isolés à long terme. Ceci sera utile dans l'étude des processus cellulaires impliquant l'expression des gènes extra-utérine et nécessitant des périodes de temps prolongées, par exemple dans les stratégies de reprogrammation cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La santé globale des cardiomyocytes isolés dépend de plusieurs aspects importants de ce protocole. Tout d'abord, le temps depuis l'extraction du coeur de la perfusion est critique et doit être effectuée en 5 minutes ou moins. L' élimination du calcium contribue à dissocier les interactions cellule-cellule, mais peut avoir un impact négatif sur la santé des cellules à long terme. 29-32 Ainsi, nous trouvons qu'il suffit d'enlever le calcium pendant les quelques minutes initiales de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le Programme UCSF pour Breakthrough Biomedical Research (financé en partie par la Fondation Sandler), le NIH Pathway to Award Indépendance (R00HL114738), et la Fondation Edward Mallinckrodt Jr.. JJ a été soutenue par une bourse postdoctorale du NIH (T32HL007731). Les auteurs sont seuls responsables du contenu de ce travail, qui ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
