בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
ניתן להשתמש cardiomyocytes מתורבתות ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte משתמשים בשיטות שאינן משלימות למערכות in vivo. לדוגמה, את הטוהר ונגישות של תרבות במבחנה מאפשרת בקרה טובה על ניתוחים ביוכימיים, הדמיה לחיות, ואת אלקטרופיזיולוגיה. לתרבות לטווח ארוך של cardiomyocytes מציע גישה גישות ניסיוניות נוספות שלא ניתן להשלים בתרבויות בטווח הקצר. לדוגמה, החקירה חוץ גופית של dedifferentiation, מחזור התא מחדש הכניסה, ואת חלוקת התא עד כה בעיקר הוגבלה cardiomyocytes עכברוש, אשר להיראות חזקים יותר בתרבות לטווח ארוך. עם זאת, את הזמינות של ערכת כלים עשירה של קווי עכבר מהונדסים ומודלי מחלה מפותחים להפוך את מערכות עכבר אטרקטיביות למחקר לב. למרות מספר דיווחים להתקיים בידוד cardiomyocyte עכבר בוגר, כמה מחקרים מראים לתרבות לטווח הארוכה שלהם. אנו מציגים כאן, היא שיטה צעד-אחר-צעד עבורתרבות בידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. ראשית, זלוף Langendorff מדרדר משמש לעכל את הלב בצורה יעילה עם פרוטאזות, ואחריו טיהור שקיעה הכבידה. לאחר תקופה של הבידוד הבא dedifferentiation, התאים לצרף בהדרגה לתרבות יכולים להיות מתורבת במשך שבועות. lysate התא Adenovirus משמש transduce cardiomyocytes מבודד ביעילות. שיטות אלה מספקות מערכת מודל עצמה פשוטה, אך ללמוד ביולוגית לב.
Introduction
Cardiomyocytes מתורבתות משמשים לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגות התא בסביבה מבוקרת היטב במבחנה. לדוגמא, מורפולוגיים, חשמל, ביוכימיות, או תכונות תא מכאניות ניתן ללמוד על מצעים מהונדסים, 1,2 בתקשורת מוגדרת, ובתגובה לסמי מולקולה קטנות, פפטידים, ויסות גנים, 3 או גירוי חשמלי. 4 התוכן הסלולרי יכולות גם להיות נשלט באמצעות שיתוף תרבויות מוגדרות. 5 אלה ניסויים במבחנה שימושיים סמים גדולים או מסך גנטי ומשלימים בשיטות vivo עבור סוגים שונים של החקירות מעורבות ביולוגית cardiomyocyte.
לתרבות לטווח ארוכה מאפשרת אפיקים הניסיונות שדורשים תקופות ממושכות של זמן כדי להשיג שינוי פנוטיפי. דוגמא בזמן זה של התפשטות cardiomyocyte יונקת בוגרת, שבו dedifferentiation, מחזור תא מחדש כניסה, ועל חלוקת תאים בדרך כלל נלמד על several ימים עד שבועות. 6,7 כאן, בפעם התרבות המורחבת מקלת מניפולציה גנטית, 7,8 dedifferentiation התפקודית (למשל, פירוק sarcomeric) 9 ו dedifferentiation תעתיק פוטנציאלי. 6 מחזור התא לאחר הזנה חוזרת של חלוקת תא דורשת תקופות תרבות יותר אפילו להתבונן, במיוחד אם סיבובים של חלוקת מרובים הם המטרה הניסיונית. חשיבותו של מחזור התא cardiomyocyte הוא מרכזי כמה עבודות מדעיות המפתח האחרונות התחדשות הלב, שבו dedifferentiation ושגשוגם של cardiomyocytes קיימים הוכח אחראי התחדשות לב דג הזברה ועכברים בילוד. 10-12 בכך תסוכל האפשרות dedifferentiation מחזור התא כדי לעורר מחדש רשום cardiomyocytes המבוגר יונקים נשאר שאלת מפתח התחדשות לב אנושית 13-15
אני n ניסויים במבחנה לומדים את מחזור התא של פעילות אירובית יונקתמיוציטים בעיקר השתמשו מקורות חולדה, בשל הקלות היחסית שלהם לתרבות לטווח ארוכה בהשוואה לדגמי עכבר. 16 עם זאת, מערכות בעכברים מציעות משאב עשיר של כלים מהונדסים היטב מאופיינים ומודלים מחלים שהן שימושיות הן במבחנת in vivo פרוטוקולים. לדוגמא, מעקב שושלת מבוססת Cre אפשר זיהוי של cardiomyocytes קיים כמקור התחדשות שריר לב בלב העכבר בילוד in vivo. 12 במבחנת מחקרים של cardiomyocytes עכבר בילוד-לייחס שושלת אפשרה הבחינה של אינטראקציות עם סטרומה תאים דרך שיתוף תרבות עם פיברובלסטים. 5 עם זאת, בשל האתגרים שלה, 17 דיווחים מעטים נמצאים מתרבות הבידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. 18,19
הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר קיימא לתרבות לטווח קצר בלבד ידוע להיות משימה מאתגרת. protoc זהol מספק צעד אחר צעד הוראות כיצד להשיג cardiomyocytes קיימא מעכברים בוגרים שיכולים לשמש הן לטווח הקצר כמו גם חקירות לטווח ארוך. Cardiomyocytes מבודד באמצעות פרוטוקול זה ניתן transduced ביעילות עם וקטורים adenoviral 20,21 ותרבותי במשך שבועות. שיטות אלה מספקים מערכת חזקה ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte במבחנה.
השיטות שתוארו במסמך זה מבוססים על מספר גורמים מעבודות קודמות באמצעות וריאציות של זלוף Langendorff מדרדר. 18,22 למרות כמה פרוטוקולים פורסמו על הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר לתרבות לטווח קצר ולימוד, 23-25 היתרון של פרוטוקול זה הוא יכולת התרבות לטווח הארוך cardiomyocytes המבודד. זה יהיה שימושי בחקר תהליכים תאיים מעורבים ביטוי גנים מחוץ לרחם הדורשים פרקי זמן ארוכים, כגון אסטרטגיות לתכנות מחדש של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לבריאות הכללית של cardiomyocytes המבודד תלויה במספר היבטים החשובים של פרוטוקול זה. ראשית, זהו הזמן של מיצוי לב זלוף הוא קריטי וצריכה להתבצע 5 דקות או פחות. הסרת סידן עוזרת לניתק תאי תאי אינטראקציות, אבל יכולה להשפיע בריאות לטווח ארוכת תא שלילי. 29-32 לכן, אנו מוצאים את זה מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי תוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פריצת דרך (מומן בחלקו על ידי הקרן סנדלר), עבור לנתיב NIH כדי פרס העצמאות (R00HL114738), וקרן הבן אדוארד Mallinckrodt. ג'יי ג'יי היה נתמך על ידי מענק דוקטורט מ- NIH (T32HL007731). המחברים אחראים בלעדי לתוכן של עבודה זו, אשר לא בהכרח מייצגת את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
