This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
ניתן להשתמש cardiomyocytes מתורבתות ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte משתמשים בשיטות שאינן משלימות למערכות in vivo. לדוגמה, את הטוהר ונגישות של תרבות במבחנה מאפשרת בקרה טובה על ניתוחים ביוכימיים, הדמיה לחיות, ואת אלקטרופיזיולוגיה. לתרבות לטווח ארוך של cardiomyocytes מציע גישה גישות ניסיוניות נוספות שלא ניתן להשלים בתרבויות בטווח הקצר. לדוגמה, החקירה חוץ גופית של dedifferentiation, מחזור התא מחדש הכניסה, ואת חלוקת התא עד כה בעיקר הוגבלה cardiomyocytes עכברוש, אשר להיראות חזקים יותר בתרבות לטווח ארוך. עם זאת, את הזמינות של ערכת כלים עשירה של קווי עכבר מהונדסים ומודלי מחלה מפותחים להפוך את מערכות עכבר אטרקטיביות למחקר לב. למרות מספר דיווחים להתקיים בידוד cardiomyocyte עכבר בוגר, כמה מחקרים מראים לתרבות לטווח הארוכה שלהם. אנו מציגים כאן, היא שיטה צעד-אחר-צעד עבורתרבות בידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. ראשית, זלוף Langendorff מדרדר משמש לעכל את הלב בצורה יעילה עם פרוטאזות, ואחריו טיהור שקיעה הכבידה. לאחר תקופה של הבידוד הבא dedifferentiation, התאים לצרף בהדרגה לתרבות יכולים להיות מתורבת במשך שבועות. lysate התא Adenovirus משמש transduce cardiomyocytes מבודד ביעילות. שיטות אלה מספקות מערכת מודל עצמה פשוטה, אך ללמוד ביולוגית לב.
Cardiomyocytes מתורבתות משמשים לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגות התא בסביבה מבוקרת היטב במבחנה. לדוגמא, מורפולוגיים, חשמל, ביוכימיות, או תכונות תא מכאניות ניתן ללמוד על מצעים מהונדסים, 1,2 בתקשורת מוגדרת, ובתגובה לסמי מולקולה קטנות, פפטידים, ויסות גנים, 3 או גירוי חשמלי. 4 התוכן הסלולרי יכולות גם להיות נשלט באמצעות שיתוף תרבויות מוגדרות. 5 אלה ניסויים במבחנה שימושיים סמים גדולים או מסך גנטי ומשלימים בשיטות vivo עבור סוגים שונים של החקירות מעורבות ביולוגית cardiomyocyte.
לתרבות לטווח ארוכה מאפשרת אפיקים הניסיונות שדורשים תקופות ממושכות של זמן כדי להשיג שינוי פנוטיפי. דוגמא בזמן זה של התפשטות cardiomyocyte יונקת בוגרת, שבו dedifferentiation, מחזור תא מחדש כניסה, ועל חלוקת תאים בדרך כלל נלמד על several ימים עד שבועות. 6,7 כאן, בפעם התרבות המורחבת מקלת מניפולציה גנטית, 7,8 dedifferentiation התפקודית (למשל, פירוק sarcomeric) 9 ו dedifferentiation תעתיק פוטנציאלי. 6 מחזור התא לאחר הזנה חוזרת של חלוקת תא דורשת תקופות תרבות יותר אפילו להתבונן, במיוחד אם סיבובים של חלוקת מרובים הם המטרה הניסיונית. חשיבותו של מחזור התא cardiomyocyte הוא מרכזי כמה עבודות מדעיות המפתח האחרונות התחדשות הלב, שבו dedifferentiation ושגשוגם של cardiomyocytes קיימים הוכח אחראי התחדשות לב דג הזברה ועכברים בילוד. 10-12 בכך תסוכל האפשרות dedifferentiation מחזור התא כדי לעורר מחדש רשום cardiomyocytes המבוגר יונקים נשאר שאלת מפתח התחדשות לב אנושית 13-15
אני n ניסויים במבחנה לומדים את מחזור התא של פעילות אירובית יונקתמיוציטים בעיקר השתמשו מקורות חולדה, בשל הקלות היחסית שלהם לתרבות לטווח ארוכה בהשוואה לדגמי עכבר. 16 עם זאת, מערכות בעכברים מציעות משאב עשיר של כלים מהונדסים היטב מאופיינים ומודלים מחלים שהן שימושיות הן במבחנת in vivo פרוטוקולים. לדוגמא, מעקב שושלת מבוססת Cre אפשר זיהוי של cardiomyocytes קיים כמקור התחדשות שריר לב בלב העכבר בילוד in vivo. 12 במבחנת מחקרים של cardiomyocytes עכבר בילוד-לייחס שושלת אפשרה הבחינה של אינטראקציות עם סטרומה תאים דרך שיתוף תרבות עם פיברובלסטים. 5 עם זאת, בשל האתגרים שלה, 17 דיווחים מעטים נמצאים מתרבות הבידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. 18,19
הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר קיימא לתרבות לטווח קצר בלבד ידוע להיות משימה מאתגרת. protoc זהol מספק צעד אחר צעד הוראות כיצד להשיג cardiomyocytes קיימא מעכברים בוגרים שיכולים לשמש הן לטווח הקצר כמו גם חקירות לטווח ארוך. Cardiomyocytes מבודד באמצעות פרוטוקול זה ניתן transduced ביעילות עם וקטורים adenoviral 20,21 ותרבותי במשך שבועות. שיטות אלה מספקים מערכת חזקה ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte במבחנה.
השיטות שתוארו במסמך זה מבוססים על מספר גורמים מעבודות קודמות באמצעות וריאציות של זלוף Langendorff מדרדר. 18,22 למרות כמה פרוטוקולים פורסמו על הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר לתרבות לטווח קצר ולימוד, 23-25 היתרון של פרוטוקול זה הוא יכולת התרבות לטווח הארוך cardiomyocytes המבודד. זה יהיה שימושי בחקר תהליכים תאיים מעורבים ביטוי גנים מחוץ לרחם הדורשים פרקי זמן ארוכים, כגון אסטרטגיות לתכנות מחדש של תאים.
לבריאות הכללית של cardiomyocytes המבודד תלויה במספר היבטים החשובים של פרוטוקול זה. ראשית, זהו הזמן של מיצוי לב זלוף הוא קריטי וצריכה להתבצע 5 דקות או פחות. הסרת סידן עוזרת לניתק תאי תאי אינטראקציות, אבל יכולה להשפיע בריאות לטווח ארוכת תא שלילי. 29-32 לכן, אנו מוצאים את זה מ…
The authors have nothing to disclose.
פרויקט זה מומן על ידי תוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פריצת דרך (מומן בחלקו על ידי הקרן סנדלר), עבור לנתיב NIH כדי פרס העצמאות (R00HL114738), וקרן הבן אדוארד Mallinckrodt. ג'יי ג'יי היה נתמך על ידי מענק דוקטורט מ- NIH (T32HL007731). המחברים אחראים בלעדי לתוכן של עבודה זו, אשר לא בהכרח מייצגת את הדעות הרשמיות של NIH.
Equipment | |||
Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
NaCl | Sigma | S9888 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
Taurine | Sigma | 86329 | |
Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
HEPES | Fisher | BP310100 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
EGTA | Amresco | 0732-288 | |
Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
MEM | Corning | 15-010-CV | |
FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
Lab tape | VWR | 89097-990 | |
Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |