Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

Axon begeleiding is het proces waarbij nieuw gevormde neuronen sturen hun axonen Tijdens het ontwikkelen van het zenuwstelsel ^1,2. Het ontwikkelen van axonen dragen een zeer beweeglijke structuur op hun tip genaamd de groei kegel. De groei kegel zintuigen extracellulaire signalen naar het pad van de axon te navigeren. Navigatie moleculen, zoals spleet semaphorines en ephrines kunnen aantrekken of afstoten axons afhankelijk van hun wisselwerking met geschikte receptoren en co-receptoren op het axon ^1,3,4. De geactiveerde receptoren dragen signalen naar de groeikegel dat de organisatie van het cytoskelet en van axon groei-cone bewegingen beïnvloeden.

Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om de werking van aantrekkende en afstotende moleculen evalueren. Chemo-aantrekkende en insectenwerende middelen kunnen worden toegediend in de groei / cultuurmedium met een gradiënt concentratie (bv., Dunn's kamer of μ-dia) ^5,6, in een zeer geconcentreerde spot door micro-pipette (bijv., draaien bepaling) ⁷ of op een homogene concentratie bad toepassing (bv., groeikegel ineenstorting test) ^8,9.

Andere werkwijzen omvatten een streep assay of microcontactprinten (μCP), waarin een chemo-aantrekkende of afstotende wordt gecoat op het oppervlak van een plaat als substraat ^10-12. Thestripe test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Bonhoeffer en collega's in 1987 tot topografische kaart brengen in het kuiken retino-tectal systeem ¹³ te analyseren. De oorspronkelijke methode vereist een vacuüm systeem om manteleiwitten op polycarbonaat nucleopore membranen met behulp van gestreepte en fijnmazige matrices. In latere versies werden de recombinante eiwitten direct gedrukt op het oppervlak van een kweekplaat in een gestreept patroon via smalle spleet silicium matrices ^14,15. Onlangs hebben verschillende onderzoeksgroepen succes toegepast deze streep test om de analyse van axon begeleiding moleculen activiteiten ^16-21.

<p class = "jove_content"> Hier presenteren we het gedetailleerd protocol voor een streep test die de aantrekking of afstoting van axon begeleiding moleculen voor gedissocieerde hippocampus neuronen meet. Met name kan deze werkwijze worden toegepast bij minimaal uitgerust laboratorium instellingen. Voor deze test zijn afwisselende strepen van een fluorescent gelabeld substraat en een controle-eiwit gegenereerd op een plastic schaaltje met een siliconen matrix met 90-um spleten en gecoat met laminine. In onze demonstratie, los hippocampus neuronen uit E15.5 muizen werden gekweekt op afwisselende strepen van recombinante ectodomein van fibronectine en leucine-rijke transmembraaneiwit-2 (FLRT2) en de controle Fc proteïne ^21. Na 24 uur kweken werden zowel de axonen en cellichamen van de neuronen sterk afgestoten van de FLRT2 strepen. Kleuring met anti-Tau1 antilichaam bleek dat ~ 90% van de neuronen werden verspreid op-Fc beklede gebieden, tegenover ~ 10% op de FLRT2-Fc, wat aangeeft dat FLRT2 een sterke afstotendefunctie hippocampale neuronen ^21.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd Hamamatsu University School of Medicine. 1. Bereiding van Matrices Kook 4-8 ​​silicone matrices in de magnetron of op een hete plaat gedurende 5 minuten en laat ze goed drogen gedurende 1 uur onder laminaire stroming (gestreept kant naar boven). Opmerking: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming. Blaas perslucht of gebruik plakband om sto…

Representative Results

Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur op strepen van fluorescent gelabelde controle Fc (figuur 3A-C) of FLRT2-Fc (Figuur 3D-F) afwisselen met ongemerkte controle Fc. In beide gevallen, de neuronen werden samengevoegd en uitgebreid hun axonen als bundels. Op het controle Fc / Fc strepen, de neuronen werden gelijkmatig verdeeld over de fluorescent gelabelde en ongelabelde strepen en breidden ze hun axon…

Discussion

Dit protocol beschrijft een streep test die recombinant eiwit en gedissocieerde neuronen maakt gebruik van het E15.5 muis hippocampus. Deze test maakt het mogelijk efficiënte observatie van afstotelijk, aantrekkelijk, of neutraal reacties van neuronen om een ​​recombinant eiwit van interesse in een gestreept patroon. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoudige methode voor het genereren van de stroken, waarbij het ​​eiwit direct gedrukt op het oppervlak van een plastic schaaltje, in vergelijking met de…

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.