Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso ^1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón ^1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimientos de los axones y el crecimiento de cono.

Varios métodos han sido desarrollados para evaluar la acción de las moléculas de atrayentes y repelentes. Quimio-atrayentes y repelentes se pueden administrar en el medio de crecimiento / cultivo con una concentración de gradiente (por ejemplo., La cámara de Dunn o Mu diapositivas) ^5,6, en un lugar muy concentrada por micro-pipette (por ejemplo., ensayo de torneado) ⁷ o a una concentración homogénea mediante la aplicación de baño (por ejemplo., el ensayo de colapso del cono de crecimiento) ^8,9.

Otros métodos incluyen un ensayo de raya o impresión por microcontacto (μCP), en la que se recubre una quimio-atrayente o repelente en la superficie de una placa como sustrato ^10-12. Thestripe ensayo fue desarrollado originalmente por Bonhoeffer y sus colegas en 1987 para analizar la cartografía topográfica en el sistema retino-chick tectal ^13. El método original requiere un sistema de vacío para proteínas de la cubierta en las membranas de policarbonato Nucleopore utilizando matrices de rayas y malladas. En versiones posteriores, las proteínas recombinantes fueron impresos directamente sobre la superficie de una placa de cultivo en un patrón de rayas utilizando matrices de silicio estrecha rendija ^14,15. Recientemente, varios grupos de investigación han aplicado con éxito este ensayo de franja en el análisis de las actividades de moléculas de orientación axón ^16-21.

<p class = "jove_content"> A continuación, presentamos el protocolo detallado para un ensayo que mide la raya de la atracción o repulsión de moléculas de orientación axón de las neuronas del hipocampo disociadas. Cabe destacar que este método se puede aplicar en el laboratorio mínimamente equipadas. Para este ensayo, se alternan franjas de un sustrato marcado con fluorescencia y una proteína de control se generan en un plato de plástico utilizando una matriz de silicio con rendijas 90-M y recubiertas con laminina. En nuestra demostración, disociados de neuronas del hipocampo de ratones E15.5 se cultivaron en rayas de ectodominio recombinante de fibronectina y rica en leucina proteína transmembrana-2 (FLRT2) y controlar proteína Fc ²¹ alterna. Después de 24 h de cultivo, tanto los axones y cuerpos celulares de las neuronas estaban fuertemente repelidos de las rayas FLRT2. La tinción con un anticuerpo anti-TAU1 reveló que ~ 90% de las neuronas se distribuyeron en las regiones Fc recubierto, en comparación con ~ 10% en el FLRT2-Fc, lo que indica que FLRT2 tiene una fuerte repulsiónfunción de las neuronas del hipocampo ^21.

Protocol

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu. 1. Preparación de Matrices Hervir 4-8 matrices de silicona en el microondas o en una placa caliente durante 5 minutos y dejar que se sequen por completo durante 1 hora bajo flujo laminar (lado rayado). Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar. Golpe de aire comprimido o u…

Representative Results

Las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se sembraron y cultivaron durante 24 h en rayas de la etiqueta fluorescente de control de Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando con Fc no marcado control. En ambos casos, las neuronas eran agregados y extendieron sus axones como paquetes. En el mando a rayas Fc / Fc, las neuronas se distribuyeron de manera uniforme en las rayas marcados con fluorescencia y no marcados, y se extendieron…

Discussion

Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparació…

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.