Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en Published: May 30, 2016 doi: 10.3791/54099
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2
1O'Brien Institute Department, St Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Surgery, University of Melbourne, 3Faculty of Health Sciences, Australia Catholic University
* These authors contributed equally

Abstract

I rekonstruktiv kirurgi, er det et klinisk behov for et alternativ til dagens metoder for autolog rekonstruksjon som er komplisert, kostbar og handel en defekt for en annen. Tissue engineering holder løftet om å ta opp denne økende etterspørselen. Men de fleste tissue engineering strategier klarer å generere stabile og funksjonelle vev erstatter på grunn av dårlig vaskularisering. Artikkelen omhandler en in vivo-vevet teknikk kammer modell av indre vaskularisering hvor en perfunderes arterie og en vene, enten som en arteriovenøs sløyfe eller et gjennomstrømnings pedicle konfigurasjon er rettet inne i et hult kammer som er beskyttet. I dette kammer-baserte systemet oppstår angiogen spiring fra de arteriovenøse fartøy og dette systemet tiltrekker iskemisk og inflammatorisk drevet endogene cellemigrering som gradvis fyller kammeret plass med fibro-vaskulært vev. Eksogent celle / matriks implantering på det tidspunkt kammeret konstruksjon forbedrer celle surVival og bestemmer spesifisiteten av de konstruerte vev som utvikler seg. Våre undersøkelser har vist at dette kammer modellen kan med hell generere forskjellige vev, slik som fett, hjertemuskel, lever og andre. Imidlertid er modifikasjoner og forbedringer som kreves for å sikre målvevet dannelse er konsekvent og reproduserbar. Denne artikkelen beskriver en standardisert protokoll for fremstilling av to forskjellige vaskulariserte vevsteknologi kammer modeller in vivo.

Introduction

Fabrikere funksjonell vaskularisert vev ved hjelp av en tissue engineering tilnærming er en voksende paradigme i regenerativ medisin. 1,2 Mange måter å konstruere nye og friske vevet for utskifting av skadet vev eller defekte organer har blitt utviklet, 3-6 eksperimentelt i små dyremodeller med lovende klinisk potensial. 7,8 er imidlertid fortsatt vaskularisering en av de store utfordringene for tissue engineering begrenser dens potensial til å vokse vev av klinisk relevant størrelse. 9

Dagens tilnærminger til vascularize vev følge enten en ytre vei hvor nye fartøyene vokse fra mottakeren karsengen og invadere hele implanterte vev konstruerer 10 eller en iboende vaskularisering sti der blodkar vokser og utvides i takt med den nylig utvikle vev. 11 extrinsic tilnærming tradisjonelt innebærer seeding celler på et stillasin vitro og implantere hele konstruksjonen i den levende dyr med forventning om at næringsstoffer, tidligere levert av dyrkingsmedier, vil bli hentet fra sirkulasjonen. 12,13 Konseptet er forenklede som vaskulær innvekst er for treg og bare svært tynne implantater (< 1-2 mm tykk) vil være levedyktig. Gir næring og oksygen ved hjelp av en tilstrekkelig og rask vaskularisering er kjernen i enhver vellykket forsøk på å vokse mer komplekse og større vev-konstruert erstatter som bein, muskler, fett og solide organer. 14,15 Intrinsic vaskularisering tilbyr muligheter for større konstruksjoner for å utvikle ved progressiv vev vekst i samsvar med sin voksende blodtilførsel. En design er in vivo implantering i et kammer av en vaskulær pedicle med eller uten en celle seeded stillaset. 5,6 Dette har banet vei for nye prosedyrer for generering av tykkere bunn vaskularisert vev. 16,17 </ P>

Flere nylig, strategier har blitt utviklet for å forhånds vascularize vev grafts, før implantasjon. Disse innlemmet blodårenett som mål å inosculate med verts skip ved implantasjon som åpner for rask levering av et komplett blodtilførsel for å bedre overlevelse av alle deler av et transplantert tykk vev pode. 18

Vi var pionerer en in vivo vaskularisert tissue engineering modell i små dyr som innebærer en subkutant implantert halvstiv lukket kammer som inneholder en gjennomstrømmet vaskulær pedicle og celleholdige biomaterialer. Kammeret danner en iskemisk miljø som stimulerer angiogen spiring fra de implanterte fartøyene. 3 vaskulær pedicle kan enten være et rekonstruert arteriovenøs løkke eller et intakt gjennomstrømnings arterie og vene. 3-6,19 Denne vaskulære pedicle spirer en fungerende og omfattende arterio -capillary-venøs nettverk som kobler på både kunsteriole og venøs slutter med vaskulær pedicle. 3,20 Videre rundt hul støtte kammer beskytter utvikle vev fra potensielt deformeres mekaniske krefter og forlenger iskemisk stasjonen for å forbedre vaskularisering. 3,21,22 Dersom fartøyet stilken er rett og slett implantert inn normalt vev og ikke inne i beskyttet område av kammeret, opphører angiogene spirende langs den samme tidslinje som en normal sår og ingen ny vevet vil samle seg rundt stilken. Etterforskerne har brukt denne in vivo-konfigurasjon for å produsere tredimensjonale funksjonelle vaskularisert vev konstruksjoner med støttende blodkar og klinisk relevant størrelse. 4,23 Videre utviklet vaskularisert vev konstruksjoner med sin intakt vaskulær pedicle kan høstes for etterfølgende transplantasjon på skadestedet . 24,25 En mer klinisk mulig scenario ville være å skape kammeret på definitive stedet for gjenoppbygging such som brystet. Således kunne denne de novo vevsteknologi tilnærming har klinisk potensiale for å tilveiebringe en ny kilde av funksjonell målvevet for rekonstruktiv kirurgi. 26-28

Følgende protokoll vil gi en generell veiledning for å konstruere en in vivo-vaskularisert vev teknikk kammer i rotte, som kan tilpasses i forskjellige dyremodeller, og som anvendes for å undersøke de innviklede prosesser av angiogenese, matriksproduksjon, cellulær migrasjon og og differensiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollene er beskrevet her har blitt godkjent av dyreetikk Committee of St. Vincent Hospital Melbourne, Australia, og ble utført under streng overholdelse av australske National Health and Medical Forskningsrådets føringer.

MERK: To kammer protokoller er beskrevet nedenfor. De to forskjellige modeller og deres spesifikke kammer utførelser er illustrert i figur 1. Kammeret (1) er fremstilt av polykarbonat (for rotte arteriovenøs løkke kammer modell). Det er sylindrisk med en innvendig diameter på 13 mm og høyden 4 mm. Et vindu på ett punkt i veggen gir uhindret tilgang for stilken. I den andre modellen (for rotte gjennomstrømning pedicle kammer modell) er kammeret består av polyakrylsyre, og er rektangulær (10 x 8 x 4 mm 3 innvendige dimensjoner). Den har to 1,5 mm åpninger på motsatte sider for å imøtekomme femoral arterie og vene som de bryter kammeret.

1. Rat Arteriovenøs Loop Chamber Modell (En ChamBER Per Animal)

MERK: Før du starter operasjonen, sørge for at alle instrumentene har blitt skikkelig sterilisert. Likeledes sikre instrumenter hvile på sterile håndklær og er på en rimelig avstand fra operasjonsområdet for å unngå forurensning under prosedyren.

  1. Klargjøring av Animal for kirurgi
    1. Bruk rotter med kroppsvekt på minst 250 g i sin store størrelse av skip for opprettelse av det arteriovenøse sløyfen.
    2. Bedøver dyret med 4% isofluran inhalering. Bygge tilstrekkelig dybde av anestesi ved å vurdere manglende respons på tå-klemme. Etter bedøvelse, holde dyret tilstrekkelig bedøvd gjennom hele prosedyren med 2% isofluran.
    3. Plasser dyret i liggende stilling på en oppvarming pad og bruke sterilt glidemiddel for øynene for å hindre uttørking under operasjonen.
    4. Ved hjelp av en elektrisk barberhøvel, barbering begge lyskene og fjerne hår med et stykke fuktig kompress.
    5. Prep kirurgiske områder med klorheksidin/ 70% etanol-løsning og drapere dyret med sterile håndklær. Administrere en enkelt dose av karprofen (5 mg / kg, subkutant) som analgetikum.
  2. Harvest of Femoral Vein Graft
    1. Ved hjelp av en # 15 blad, lage en 4 cm lang snitt i huden på venstre lyske parallelt med lyskeligament. Dette utsetter lyske fett pad.
    2. Skjær gjennom fett puten omkretsen med saks forlate den festet til sin vaskulær pedicle basert på magesekkens fartøy.
    3. Ved hjelp av mikro saks, frigjøre filmy bindevev sammenvoksninger mellom bukveggen og underliggende femoral fartøy.
    4. Plasser en retractor på bukveggen og trekk medialt. Dette utsetter inguinal ligament, og hele lengden av de femorale fartøy.
    5. Ved hjelp av mikro tang og buet saks dissekere magesekkens venen og isolere den fra omkringliggende fett ved å forsiktig dra og skjæring. Dette vene fungerer som en tjore når konstruere loop.
    6. øG Micro tang og buede mikro saks åpne perivaskulær skjede inneholder femoral fartøy og nerve hele veien fra lyskeligament til sin deli distalt for magesekkens grenen.
    7. Ved hjelp av mikro tang, plukke opp femoralvenepunksjon av sin adventitia og forsiktig skille det fra omkringliggende vev og tilhørende arterie. Gjør dette med mikro tang og buede runde-spiss mikro saks ved å trekke vevet fra hverandre og skjære gjennom den.
      MERK: Du må aldri ta tak i hele tykkelsen av venen veggen da dette kan føre til skade på intima gjør den utsatt for blodpropp.
    8. Ligate sidegreiner funnet under disseksjon med 10/0 nylon sutur eller koagulere dem med en bipolar coagulator.
    9. Med femoralvenepunksjon helt gratis, ligate sin proksimale og distale ender med 4/0 silke sting. Sørg for å få en blodåre pode på minst 10 mm lengde og omfatte ca 0,5 cm lengde magesekkens grenen som skal brukes som en fyr tau tjorefor å holde spiralen i kammeret.
    10. Ved hjelp av mikro tang og rette mikro saks, trim adventitia fra pode er endene ved forsiktig å trekke og kutte. Dette kan også gjøres senere, før mikro anastomoser.
    11. Skylle venen pode med heparinisert saltløsning (10 U / ml heparin) og la den hvile i løsningen. Lukke såret med kontinuerlig drift 4/0 silke sutur pluss to eller tre ekstra enkle avbrutte sting.
  3. Opprettelse av Arteriovenøs Loop og Implantasjon av Chamber
    1. Gjenta trinn 1.2.1 til 1.2.4 i nøyaktig samme måte på den kontralaterale lem.
    2. Ved hjelp av mikro tang, dissekere og isolere både magesekkens arterie og vene danne rundt fettpute. Gjør dette ved å forsiktig trekke vevet bort fra fartøyene
    3. Ved hjelp av mikro tang, plukke opp lårarterie ved sin adventitia og fri den fra omkringliggende vev. Gjør dette med mikro pinsett og buet runde-spiss micro saks ved å trekke vevet fra hverandre og skjære gjennom den. Ligate eller koagulere dets sidegreiner.
    4. Ligate lårarterie og vene distal til fremveksten av magesekkens tanker med 4/0 silke sutur.
    5. Plasser en enkelt klemme proksimalt på hver av femoral arterie og vene. Bruk en skarp rett mikro saks, lage en ren tverrgående kutt i hvert fartøy distal til fremveksten av magesekkens grener. Plasser en steril plast kontrast bakgrunnen under fartøy.
    6. Spyl fartøyene kraftig med enorme mengder med heparinisert saltoppløsning inntil alt blodet er fjernet fra hulrommet.
    7. Ta venen pode inn i operative feltet og fjerne overflødig adventitia fra skipenes endene som per trinn 1.2.10, om nødvendig.
    8. Utfør begge mikro anastomoser med 10/0 nylon sutur. Anastomose den proksimale enden av venen pode til lårvenen, og den distale enden til lårarterien. Dette vil gi blod å flyte fROM den arterielle til venesiden uten motstand fra ventilene inne i venen pode.
      MERK: Kontroller at femoral fartøy og venen pode hvile i sin naturlige posisjon uten vendinger.
    9. Sjekk for lekkasjer i begge anastomotic nettsteder. Løse små lekkasjer, som ser ut som ikke-pulserende blod som kommer ut fra anastomosestedet, ved å anbringe en liten del av fettet på toppen og forsiktig sammenpressing i 5-10 min. Større pulserende lekkasjer som raskt oversvømmer hele feltet trenger flere sting.
    10. Sjekk patency av arteriovenøse loop. Lett okklusjon av arteria femoralis bør gjøre det krympe mens det samme i den femorale vene skal engorge den.
    11. Plasser bunnen av tissue engineering kammeret under arteriovenøse sløyfe med sistnevnte hviler i sin naturlige posisjon uten vridninger eller knekk.
    12. Feste bunnen av kammeret til den inguinal ligament og underliggende muskel fascia med 6/0 nylon suturer.
    13. Sett lokket overbase, slik at de femorale fartøyet går inn i kammeret gjennom et hakk (vindu i siden av kammeret). Når du lukker lokket, sørg for at den fanger epigastrica grener, mellom kammeret base og lokk, som fungerer som stagene å holde arteriovenøs løkken på plass.
    14. Lukke såret med kontinuerlig drift 4/0 silke sutur pluss to eller tre ekstra enkle avbrutte sting.
    15. La dyret å gjenopprette fra anestesi på en oppvarming pad.
    16. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Likeledes, ikke returnere et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert. 24 timer senere administreres en enkelt dose av karprofen (5 mg / kg, subkutant) som analgetikum.
    17. Behandle såret med aktuelle antibiotika salve i 5 dager. Hvis såret er åpnet, bedøve dyret som i trinn 1.1.2 gjennom 1.1.5 og lukke såret som i 1.30,14. Overvåke helsen til dyr daglig. Avlive dyret ved hjelp av en dødelig dose av intraperitoneal lethabarb injeksjon (163 mg / kg i 0,25 ml med 23 G nål) hvis dyret viser mer enn ett moderate tegn på inacitivity, dårlig appetitt, vekttap og tap av farge.

2. gjennomstrømning stilken Chamber (to kamre per dyr)

  1. Klargjøring av Animal for kirurgi
    1. Gjenta trinn 1.1.1 via 1.1.4. To kammere kan implanteres inn i begge lyske regioner av en enkelt rotte.
  2. Isolering av Femorale fartøy og innsetting av handelskammeret
    1. Gjenta trinn 1.2.1 via 1.2.8.
    2. Med både arterie og vene fullstendig befridd for omgivende vev og deres grener ligert, bringe kammeret inn i det operative området.
    3. Plasser hver av de intakte femoral fartøy på tilsvarende slit i kammeret basen gjør at det ikke er noen vendinger eller knekk.
    4. Lukk kammeret ved attaching av lokket til basisen. Lukke såret ved hjelp av kontinuerlig drift 4/0 silkesutur pluss to eller tre ekstra enkle avbrutte sting, og at dyret kan komme seg som tidligere beskrevet.

3. Harvest of Chambers og Tissue Processing

  1. Når eksperimentet tidspunkter (4-6 uker etter implantasjon) er nådd, bedøve dyret som i trinn 1.1.2 og gjenta trinn 1.1.3 via 1.1.5.
  2. Åpne sår ved hjelp av en # 15 blad og skjære gjennom vev med saks til kammeret er fullstendig eksponert.
  3. Utsette de femorale fartøyene proksimalt til at konstruksjonen og test for vaskulær åpenhet: forsiktig okkludere karet med to microforceps, deretter melk blodet i en distal retning, og til slutt frigjør de nære tang. Dersom fartøyet fylles med blod igjen, bekrefter denne åpenheten. Ligere de femorale fartøyene proksimalt i tilfelle av arteriovenøse sløyfe og både proksimalt og distalt i tilfelle av the gjennomstrømning konfigurasjon og fjern kamrene med inneholder vev en bloc.
  4. Ved slutten av eksperimentet, avlive dyret ved hjelp av en dødelig dose av intraperitoneal lethobarb injeksjon (163 mg / kg i 0,25 ml av 23 G nål).
  5. Fiks vev i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 24 timer. Fordel vev i flere tverrgående seksjoner (1-2 mm tykke) og bygge inn i parafinvoks eller en optimal skjære temperatur forbindelse for parafinsnitt (5 um) eller frosne seksjoner (10 um), henholdsvis. 3,4,8,17,22, 24
  6. Utføre rutinemessig histologisk farging såsom hematoxylin og eosin for å undersøke den generelle morfologi av vev. Utfør immunhistokjemisk farging med spesifikt antistoff for å identifisere celletype av interesse, 3,4,8,17,22,24,29 for eksempel hjerte troponin T farging for cardiomyocytes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den mikro opprettelse av vev konstruksjons kamre ble utført som beskrevet i protokollen ovenfor. Vev som genereres inne i kamrene kan undersøkes histologisk som beskrevet i protokollen trinn 3. Ulike typer vev har blitt konstruert ved hjelp av in vivo-vaskularisert kammer (figur 2). Disse inkluderer hjertevevet med neonatale rotte kardiomyocytter (figur 2A), muskelvevet med rotte-skjelett myoblaster (figur 2B), og fettvev med en hydrogel avledet fra fettvev ekstracellulære matriks (figur 2C).

Morfometrisk evaluering av vev kan utføres med enten en stereo etterforsker system eller ImageJ programvare. 3,4,8,17,22,29 I tillegg til kvalitativ vurdering av ulike vev komponenter, den stereology systemet gir også mulighet for objektiv quantifiseringen av spesifikke vev volum. For eksempel, lectin (en markør for gnager endotelceller) farget tverrgående partier (figur 3) kan brukes til å estimere den vaskulære volumet av de høstede vev konstruksjonene ved hjelp av videomikroskopi med stereology system. Liknende kvantifisering metoder kan brukes til å vurdere mengden av andre typer vev.

Vevet tekniske kamrene kan også bli anvendt for å spore celle skjebne etter implantasjon in vivo. Celler kan forhånds merket med fluorescerende fargestoffer som Dil, PKH26 eller kvanteprikker før implantasjon. For eksempel kan neonatale rotte kardiomyocytter pre-merket med DII påvises i vev konstruksjonene høstet på dag 3 etter implantasjon (figur 4A). Vi har også lykkes spores implanterte celler som har blitt pre-merket med Dil i opptil fire uker etter implantasjon. Alternativt kan artsspesifikke antistoffer anvendes for å identify implanterte cellene i xenotransplantasjon studier. For eksempel kan humane induserte pluripotente stamceller implantert inne vev konstruksjons kamre i immunocompromized rotter identifiseres i de høstede vev konstruksjoner ved farging med human-spesifikt Ku80 antistoff (figur 4B).

Figur 1
Figur 1: Cardiac tissue engineering med in vivo vaskularisert kammer Intrinsic vaskularisering tilnærming med arteriovenøs sløyfe kammer modell og gjennomstrømning pedicle kammer modell.. Kamrene ble laget av enten polykarbonat eller polyakrylsyre, ble disse materialer testes for å være ikke-inflammatorisk og ikke-toksisk in vivo. Scale bar = 5 mm. Re-trykt med tillatelse fra 30. Plea se klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Vev konstruert fra in vivo vaskulariserte kamre (A) Cardiac vev med neonatal rotte cardiomyocytes. Cardiomyocytes ble immunostained med hjerte troponin T-antistoff (brun). (B) Muskelvev med rotteskjelett myoblasts. Muskelceller ble immunfarget med desmin antistoff (brun). (C) Fettvev med en hydrogel avledet fra fettvev ekstracellulær matriks. 31 hematoksylin og eosin-farging. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Figur 3: vaskularitet et vev konstruerer høstet ved 4 uker etter implantasjon Representative bilder av lektin-farget seksjoner.. Blodårene spire fra den femorale arterien (*) ble merket lektin (brun). Scale bar = 200 mikrometer (til venstre) og 100 mikrometer (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Identifisering av transplanterte celler i vevet konstruksjonene (A) DII-label neonatale rotte kardiomyocytter (røde og hvite piler) i en rotte vev konstruksjon høstet 3 dager etter implantasjon. (B) Et representativt human-spesifikt Ku80 farget histologi bilde av en vev konstruksjon høstet fra en rotte tissue ingeniør kammer implantert med menneskeskapte pluripotente stamceller i 28 dager etter implantasjon. Menneske kjerner ble immuno-merket brun og immunocompromized rotte ble brukt for å forhindre avstøtning av humane celler. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prosjektering av mikrosirkulasjonen er for tiden under etterforskning i hovedsak gjennom to tilnærminger. Den første innebærer å utvikle et høyt sammenkoplet vaskulære nettverk innenfor konstruksjonen in vitro, slik at når implantert, kapillærer fra verts karsengen kontakt med de av den transplanterte konstruere gjennom en prosess som kalles inosculation, og dermed sikre levering av næringsstoffer ikke bare til periferien, men også til kjernen. 21,32,33 Dette kalles pre-vaskularisering. Den andre tilnærmingen forsøker å forbedre vertens egen vaskulatur direkte in vivo, slik at kapillær spirende skjer enten før eller samtidig med implantert celledifferensiering og vekst vev. 17,34

In vivo-vevet teknikk kammeret protokoll som presenteres her utnytter den sistnevnte konsept ved å plassere en arterie og en vene, enten som en arteriovenøs sløyfe eller et gjennomstrømnings pedicle konfigurasjon,inne i et beskyttet tomt rom, slik at betydelige spirende og dannelse av nye kapillærer over tid, 3. Fordeler med kammeret innbefatter (1) fravær av in vitro-manipuleringer.; (2) generering av en fullstendig autolog vaskulært nettverk som ikke vil bli avvist av verten; og (3) det faktum at den ikke trenger en inosculation periode som kan ta mellom 1 til 7 dager hvilket gjør vevet konstruere utsatt for ischemi. 35,36

Likevel må det bemerkes at det tar rundt 3-7 dager for sterk kapillar spirende skal skje, en periode hvor det implanterte vev er også dårlig levert. 3 Forsinket celle implantasjon når kammeret er tilstrekkelig vaskularisert har nemlig vist forbedret overlevelse. 17 En ytterligere fordel inkluderer biokompatibilitet og ikke-immunogenisitet av kamrene 'materiale (dvs. polykarbonat og polyakrylsyre). I tillegg er den stive ikke-sammenfoldbare Chamber gir en beskyttet plass for vev og blodkar til å vokse uten sammenslåing og integrasjon med omgivelsene, som ellers ville hemme vekst og gjøre innhøstingen av den nydannede vevet vanskelig. Contrastingly, kan det faktum at kamrene er lukket begrense vevsvekst. Dette har imidlertid vært adressert i arteriovenøs sløyfe modellen, som nå anvender en perforert kammer som har vist seg å dyrke vevet mer effektivt enn den lukkede en. 37

De tissue-ingeniør kammer protokollene som presenteres her er svært reproduserbare, men det bør understrekes at kamrene sjelden fylle til ferdigstillelse, som regel til ca 70% kapasitet. Konsistente resultater oppnås, forutsatt at noen kritiske trinn og tekniske problemer blir tatt hensyn til. Pedicle åpenhet er det endelige målet når du arbeider med blodårer, spesielt hvis mikro anastomoser utføres. Vi har stadig funnet ingen vev vokser hvis VascUlar pedicle tromboser tidlig post-kirurgi. Faktorer som påvirker åpenhet kan grovt grupperes i fire kategorier, nemlig kirurgisk teknisk, blodgjennomstrømning, trombose og krampe.

Først er en delikat kirurgisk teknikk er nøkkelen til suksess. I denne forstand, bør det bemerkes at disse prosedyrene, spesielt en som involverer etableringen av en arteriovenøs sløyfe krever et visst nivå av kirurgiske ferdigheter som lett kan erverves ved å praktisere først i ikke-levende modeller og senere i rotte femoral fartøy følgende prinsippene og teknikkene som er beskrevet her og andre steder. 38 Skade på beholderveggen, særlig i intima, må unngås enhver tid ved passende håndtering av fartøyene, som omfatter aldri å gripe den fulle tykkelse av karveggen, forebygge overdreven strekking, skjønnsom bruken av den bipolare coagulator, og i tilfelle av arteriovenøs sløyfe, ytelse av grundige og atraumatiske mikro anastomoser. Selv om spyling med heparinisert saltoppløsning forebygger blodpropp, det vil aldri erstatte en god kirurgisk teknikk. For det andre, blodstrøm faktorer er hovedsakelig knyttet til turbulens og stasis. Turbulent strømning sekundært til twists, bøyer eller knekk av fartøy fremmer trombedannelse. Derfor er en strømlinje utmating må sikres både i arteriovenøs sløyfen og gjennomstrømningsmodeller. I denne forstand er det tethering effekten av magesekkens grenene i arteriovenøs sløyfe modellen avgjørende for å forhindre bøying; hvis en eller annen grunn disse grenene kan ikke brukes, bør enkle 10/0 nylon masker fra åreveggen til omkringliggende vev bli nøye plassert i stedet. Statisk blod ved anastomosestedet under arteriovenøse sløyfen fremgangsmåten er også sterkt trombogen og må forhindres ved å spyle beholderen kraftig med heparinisert saltløsning før og i løpet av anastomosen. For det tredje, pro-trombotiske faktorer som forurensninger fra den operative feltet og mest importantly nærvær av stykker av adventitia inne i anastomose som skal unngås. Forbereder fartøyet ender riktig før mikro suturering og holde feltet og anastomose rent ved å skylle regelmessig blir viktige aspekter å vurdere når du bygger den arteriovenøse loop. Sist men ikke minst, det er spørsmålet om fartøyet krampe. Selv om patofysiologien til fartøyet krampe ikke er blitt fullstendig klarlagt, er det sannsynlig å være på grunn av både lokale og systemiske faktorer. Lokale faktorer omfatter fartøyet traumer, tilstedeværelse av blod i den operative feltet og vev uttørking. Systemiske faktorer, på den annen side, omfatter lav kjernetemperatur, hypotensjon og sympatisk respons på smerte. 38

Derfor, i både arteriovenøs sløyfe og gjennomstrømning modeller, forsvarlig håndtering og tilberedning av dyret sammen med en delikat kirurgiske teknikken kan ikke understrekes nok. Strategier for å løse krampe inkludere vanning med lunkent saltvann eller ufortynnet1% xylocain, og som har en hvileperiode på 5-10 min. Dilatering og stripping av adventitia kan også bidra til å avlaste spasme skyldes den lokale sympathectomy virkning. 38 For å unngå behovet for å utføre mikro anastomoser og teknisk utfordring det innebærer, kan mansjetten teknikken anvendes som beskrevet andre steder. 39 Denne teknikk består med å sette inn en av fartøyet ender i en mansjett Evert det og fest den med en omkrets 6/0 nylon sutur. Deretter blir det andre fartøyet ende skyves over kragen og festes på tilsvarende måte.

Vevet-engineering kammer har åpnet et nytt vindu av muligheter i eksperimentell forskning og er stadig fremme mot en potensiell klinisk formål. Inntil nå har de modellene som presenteres her er brukt hovedsakelig for generering av vev av ulike linjene. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 Likevel, de har en rekke andre potensielle bruksområder. For eksempel, vi hahar brukt gjennomstrømningskammeret som en effektiv og forholdsvis rask modell for teratom dannelse etter implantasjon av menneskeskapte pluripotente stamceller. 41,42 Således kan denne tilnærmingen kan brukes som en "kvalitetskontroll" verktøyet for å oppnå tumorfrie vevsteknologi med pluripotente stamceller. Dessuten kan stoffet toksikologiske studier utforskes i menneskelig vev dyrket inne i kammeret. Likeledes generasjon av patologisk vev kan gi en interessant tilnærming til sykdom modellering og narkotika testing. Til slutt kan vevet-teknikk kammer også bli en potensial-modell for å studere vekst av vev og sporing av celle skjebne in vivo.

Som konklusjon, har vi beskrevet en protokoll som involverer plassering av en subkutan kammer i dyr gjennom to forskjellige fremgangsmåter: ved hjelp av et mikrokirurgisk arteriovenøs løkke, eller en gjennomstrømning pedicle konfigurasjon. Teknikken er meget reproduserbar og gir konsistente resultater. Bruken hsom er utnyttet primært innen tissue engineering hittil, men det er andre potensial forskningsfelt hvor disse kamrene kan være til stor anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd midler fra NHMRC og Stafford Fox Medical Foundation. Forfatterne erkjenner kirurgisk hjelp av Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos og Amanda Rixon av eksperimentell medisinsk og kirurgisk enhet, St. Vincent Hospital, Melbourne. Det gis også støtte av den viktorianske Statens regjeringens Institutt for innovasjon, industri og regionaldepartementet er Operational Infrastructure Support Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 15 Blade Scalpel Braun BB515
1 Toothed Adson Forceps Braun BD527R
1 Needle Holder Braun BM201R
1 Bipolar Coagulator  Braun US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3 S & T 00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 S & T 00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 S & T 00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11 S & T 00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11 S & T 00090
2 Single Clamps B-3 S & T 00400
2 10/0 nylon suture S & T 03199
1 6/0 nylon suture Braun G2095469
2 4/0 Silk Sutures Braun C0760145
Xilocaine 1% Dealmed 150733 10 mg/ml
Heparin Sodium Dealmed 272301 5,000 UI/ml
Ringer Lactate Baxter JB2323 500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber custom made
1 flow-through chamber custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia  Vector Laboratories B-1105 1.67 μg/ml
Troponin T antibody Abcam Ab8295 4 μg/ml
Human-specific Ku80 antibody Abcam Ab80592 0.06 μg/ml
Desmin antibody Dako M0760 2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye Thermo Fisher Scientific C-7000 3 mg/106 cells
Lethabarb (sodium pentobarbitone) Virbac Animal Health LETHA450 325 mg/ml
Heat pad flexible Redzone Heating RZ/Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
  2. Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
  3. Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
  4. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
  5. Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
  6. Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
  7. Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
  8. Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
  9. Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
  10. Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
  11. Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
  12. Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
  13. Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
  14. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
  15. Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  16. Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
  17. Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
  18. Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
  19. Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
  20. Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  21. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
  22. Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
  23. Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
  24. Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
  25. Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
  26. Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
  27. Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
  28. Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
  29. Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
  30. Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
  31. Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
  32. Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
  33. Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  34. Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
  35. Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
  36. Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
  37. Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
  38. Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
  39. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
  40. Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
  41. Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
  42. Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).

Tags

Bioteknologi Tissue engineering vaskulær pedicle arteriovenøs loop vaskularisering mikrokirurgi femoral fartøy angiogenese kapillærer
Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G.… More

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G. M., Morrison, W. A., Lim, S. Y. Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber. J. Vis. Exp. (111), e54099, doi:10.3791/54099 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter