Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
rekonstrüktif kemik ameliyatlarında sırasında, büyüme faktörleri suprafizyolojik miktarda ampirik başarılı kemik füzyonu teşvik etmek iskelelerinin üzerine yüklenir. yüksek ölçüde güçlü bir biyolojik maddelerin büyük dozlar nedeniyle, hızlı enzimatik bozulmaya sonucu büyüme faktörü instabilitesi gibi yerleştirme alanında büyüme faktörü yeterli miktarda lokalize taşıyıcı verimsizliklere yol gerekmektedir. Bu nedenle, onların serbest bırakılmasını BMP-2 / NELL-1 gibi büyüme faktörlerinin istikrarını uzatmak ve kontrol stratejileri aslında onların etkili doz düşük olabilir ve bu nedenle gelecekteki kemik rejenerasyonu ameliyatları sırasında büyük dozlarda ihtiyacını azaltır. sırayla Bu yan etkiler ve büyüme faktörü maliyetlerini azaltacaktır. Kendinden monte PECS in vivo istikrarı artırarak bağlama heparin ve daha fazla güçlendirebilir büyüme faktörü biyoaktivite aracılığıyla BMP-2 / NELL-1 teslimat daha iyi kontrol sağlamak için imal edilmiştir. Burada delive yardımcıları PEC üretim sadeliği göstermektedirrekonstrüktif kemik ameliyatlar sırasında büyüme faktörleri, çeşitli Ry.
Introduction
Psödoartroza sıklığı dejeneratif omurga kaynaştırma ve revizyon omurga cerrahisinde 1 içinde% 10 ila 45 kadar yüksek olduğu rapor edilmiştir. BMP-2, Nell-1 1 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) olarak osteojenik büyüme faktörleri de novo osteogenesisi teşvik etmek getirilmiştir omurga füzyon ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları sırasında psödoartrozu oranını azaltmak için. Bunlar arasında, BMP-2 spinal füzyon 2 için popüler bir seçimdir. Uyarılması ve yeni kemik oluşumunu kolaylaştırmak BMP-2 gücü de 3 kanıtlanmış olmasına rağmen, Böyle heterotopik kemik oluşumu, seroma ve hematom oluşumu, inflamatuvar yanıt, radikülit, vertebral gövde osteoliz ve retrograd ejakülasyon olarak klinik olarak anlamlı komplikasyonlar nedeniyle 4,5 kullanılan suprafizyolojik miktarlarda endişe konusu olmaya devam etmektedir.
Bu nedenle, BMP-2 dozunun düşürülmesi de bir ilgili bir strateji kalıryan etkileri en aza indirmek için cezbeder. Ayrıca, verimli taşıyıcı sistemleri BMP-2, çağdaş kollajen sünger taşıyıcı sistemlerinde gözlenen ilk patlama salınımını baskılamak ve daha fazla bu güçlü sitokinin uzun süreli ve yerel teslim geliştirmek için gereklidir. Katyonik ve anyonik polielektrolit alternatif katman-katman montajı çok iskele matrisleri veya implante edilebilir malzemelerin 6 yüzeyinde polielektrolit kompleksleri oluşturmak için ayarlanabilir bir yöntem olarak da kullanılabilir. Bu açıdan, (bütün biyolojik maddelerin en yüksek negatif yük yoğunluğuna sahip olan bilinen) heparin yakından takip ettiği, elektrostatik ve heparin bağlayıcı alan ile büyüme faktörleri, çeşitli bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, heparin yarı ömrünü uzatmak ve dolayısıyla çeşitli büyüme faktörleri biyo-aktivitesini güçlendirdiği gösterilmiştir.
Buna dayanarak, bizim grup heparin tabanlı polielektrolit kompleksi (PEC) olduğunu imal etmek için bir katman-katman öz-montaj protokolü adapte yükler ve immobilizasyon 7,8 sırasında osteojenik büyüme faktörlerinin biyoetkinlikleri korur. Aljinat mikroboncuk çekirdek α-L-guluronat (G) iki değerlikli katyon kalsiyum ya da stronsiyum iyonlarıyla aljinat artıkları çapraz bağlanması ile imal edilmiştir. Aljinat damarın en az bir biyolojik olarak parçalanabilir bir iskele matrisidir; hangi implantasyon sonra, kemikli büyümesi için oda sağlayan füzyon yatakta emilir. Poli-L-lisin (PLL) ya da protamin (bu durumda, alginat mikroboncuk, taşıyıcı çekirdek) iskele matris ve negatif yüklü heparin hem ile bir araya katyonik bir tabaka olarak kullanılmaktadır; anyonik heparin tabakası fonksiyonları stabilize etmek ve yüklenen büyüme faktörleri lokalize iken. Üçlü tabaka PEC bir domuz modelinde 9 büyüme faktörü yükleme kapasitesini artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, PEC taşıyıcılar başarılı bir şekilde sıçan 10 ve spinal füzyon 8 domuz modellerinde en az 20-kat BMP-2 etkin dozunu azaltmak için gösterilmiştir.
ntent "> Burada bir örnek osteojenik büyüme faktörü olarak BMP-2 kullanılarak spinal füzyon gelişmiş büyüme faktörü teslimat ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları için imalatı Halk yöntemlerini rapor.Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, katman-katman kendinden montaj yoluyla Halk hazırlanması için bir yöntem sunmaktadır. katman-katman yapısı protamin, heparin, BMP-2 ve NELL-1 ve konfokal mikroskopi floresan analogları kullanılarak görüntülenmiştir. Alımı ve serbest testler PEC üzerinde heparin osteojenik büyüme faktörü alımı ve serbest aracılık ettiğini göstermektedir. PEC yönteminin alımı verimliliği: NELL-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. PEC, taşıyıcı, örneğin kalsiyum apatit parçacıklar (% 40-8…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Referências
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
