Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Während der rekonstruktiven Knochenoperationen werden supraphysiologischen Mengen von Wachstumsfaktoren empirisch auf Gerüsten geladen erfolgreiche Knochenfusion zu fördern. Große Dosen von hochpotenten biologischen Agenzien werden als Ergebnis der raschen enzymatischen Abbau durch Wachstumsfaktor-Instabilität erforderlich sowie Träger Ineffizienzen in ausreichenden Mengen des Wachstumsfaktors an Implantatstellen zu lokalisieren. Daher Strategien, die die Stabilität von Wachstumsfaktoren wie BMP-2 / NELL-1 und steuern ihre Freilassung zu verlängern könnte tatsächlich ihre wirksame Dosis zu senken und damit die Notwendigkeit für größere Dosen bei zukünftigen Knochenregeneration Operationen reduzieren. Dies wiederum wird Nebenwirkungen und Wachstumsfaktor-Kosten zu reduzieren. Selbstorganisierende PECs wurden hergestellt , eine bessere Kontrolle der BMP-2 / NELL-1 Lieferung über Heparinbindung bereitzustellen , und weiter potenzieren Wachstumsfaktor – Bioaktivität durch Verbesserung in vivo Stabilität. Hier zeigen wir die Einfachheit der PEC Fertigung, die in der delive hilftry einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren während der rekonstruktiven Knochen Operationen.
Introduction
Die Inzidenz von Pseudoarthrosen wurde berichtet , so hoch wie 10 bis 45% in degenerative Spondylodese und Revisionswirbelsäulenchirurgie 1 sein. Um die Rate der Pseudoarthrose während Wirbelsäulenfusion und andere rekonstruktive Knochenoperationen, osteogenen Wachstumsfaktoren wie BMP-2, Nell-1 1 und von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) reduzieren wurden eingeführt , um de novo Osteogenese fördern. Unter diesen ist BMP-2 eine beliebte Wahl für Spondylodese 2. Obwohl die Wirksamkeit von BMP-2 bei der Induktion und neue Knochenbildung zu erleichtern wurde gut etabliert 3; klinisch signifikanten Komplikationen wie heterotope Knochenbildung, seroma und Hämatome, Entzündungsreaktion, Radikulitis, Wirbelkörper Osteolyse und rückläufige Ejakulation weiterhin aufgrund der supraphysiologischen Mengen 4,5 Anliegen zu sein.
Daher bleibt die Dosis von BMP-2 Absenken einer entsprechenden Strategie in zuminverleitet Nebenwirkungen zu minimieren. Außerdem sind effiziente Trägersysteme erforderlich, um den ersten Ausbruch Freisetzung von BMP-2 beobachtet in der zeitgenössischen Kollagenschwamm Trägersysteme und weiter zu verbessern verlängerte und lokalisierte Abgabe dieses potenten Zytokin zu unterdrücken. Die Schicht- für -Schicht – Selbstorganisation von kationischen und anionischen Polyelektrolyten alternierende kann als abstimmbarer Verfahren eingesetzt werden 6 Polyelektrolytkomplexe zum Aufbau auf der Oberfläche des Gerüsts Matrices oder implantierbare Materialien. In dieser Hinsicht, Heparin (bekannt für die höchste negative Ladungsdichte aller biologischen Agenzien haben) erkannt wurde, mit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren über elektrostatische und Heparin-Bindungsdomänen avidly zu binden. Tatsächlich wurde Heparin gezeigt, um die Halbwertszeit zu verlängern und damit die Bioaktivität von verschiedenen Wachstumsfaktoren zu potenzieren.
Auf dieser Basis angepasst unserer Gruppe eine Schicht-für-Schicht self-assembly-Protokoll ein auf Heparin-Basis Polyelektrolytkomplex (PEC) herzustellen, die Lasten und bewahrt die Bioaktivitäten von osteogenen Wachstumsfaktoren während der Immobilisierung 7,8. Die Alginat-Mikrokügelchens Kern wurde durch vernetzende α-L-Guluronat (G) -Resten von Alginat mit zweiwertiges Kation Calcium- oder Strontiumionen hergestellt. Die Alginat-Kern ist ein biologisch abbaubares Gerüst Matrix; die nach der Implantation wird in dem Fusionsbett bietet Raum für das Einwachsen des Knochens resorbiert. Poly-L-Lysin (PLL) oder Protamin als kationische Schicht verwendet mit Interlace sowohl die Gerüstmatrix (in diesem Fall das Alginat Mikrokügelchens Trägerkern) und dem negativ geladenen Heparin; während die anionische Funktionen Heparin Schicht zu stabilisieren und belastet Wachstumsfaktoren zu lokalisieren. Die dreilagige PEC wurde in einem Schweinemodell 9 gezeigt Wachstumsfaktor Belastbarkeit zu erhöhen. Vor kurzem haben PEC Träger wurden in Ratten 10 und Schweinemodellen Spondylodese 8 gezeigt , um erfolgreich die wirksame Dosis von BMP-2 um mindestens das 20-fache zu verringern.
ntent "> Hier berichten wir über die Verfahren zur Herstellung von PEC für verbesserte Wachstumsfaktor Lieferung in Spondylodese und den anderen rekonstruktiven Knochenoperationen unter Verwendung von BMP-2 als osteogenen Wachstumsfaktor-Modell.Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von PECs durch die Schicht-für-Schicht self-assembly. Der Schicht-für-Schicht-Struktur wird unter Verwendung von fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin visualisiert, BMP-2 und Nell-1 und der konfokalen Mikroskopie. Uptake und Release-Tests zeigen, dass auf PEC Heparin osteogenen Wachstumsfaktor Aufnahme und Freisetzung vermittelt. Die Aufnahme Effizienz des PEC Methode ist: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Der PEC Träger hat eine bessere Modulatio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Referências
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