Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Durante interventi di chirurgia ricostruttiva di ossa, quantità sovrafisiologici di fattori di crescita sono empiricamente caricati su ponteggi per promuovere fusione ossea successo. Le grandi dosi di agenti biologici molto potenti sono necessari a causa del fattore di crescita instabilità a seguito della degradazione enzimatica rapida nonché inefficienze carrier nella localizzazione di sufficienti quantità di fattore di crescita nei siti implantari. Quindi, le strategie che prolungano la stabilità dei fattori di crescita come la BMP-2 / NELL-1, e controllare il loro rilascio potrebbe effettivamente ridurre il loro dosaggio efficace e quindi ridurre la necessità di dosi più elevate durante i futuri interventi di rigenerazione ossea. Questo a sua volta consentirà di ridurre gli effetti collaterali e costi dei fattori di crescita. PEC auto-assemblati sono stati fabbricati per fornire un migliore controllo della BMP-2 / NELL-1 consegna via vincolante eparina e l'ulteriore crescita potenziare fattore bioattività, migliorando la stabilità in vivo. Qui illustriamo la semplicità di fabbricazione PEC, che aiuta nella delivery di una varietà di fattori di crescita durante chirurgia ricostruttiva ossee.
Introduction
L'incidenza di pseudoartrosi è stato segnalato per essere alto come 10 a 45% in degenerative fusione spinale e revisione chirurgia spinale 1. Per ridurre il tasso di pseudoartrosi durante la fusione spinale e altri interventi chirurgici ricostruttivi ossa, fattori di crescita osteogeniche come BMP-2, Nell-1 1 e fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) sono stati introdotti per la promozione de novo osteogenesi. Tra questi, BMP-2 è una scelta popolare per la fusione spinale 2. Sebbene la potenza di BMP-2 nell'induzione e facilitare la formazione di nuovo osso è stato ben stabilito 3; complicanze clinicamente significative come la formazione di osso eterotopico, sieroma e formazione di ematomi, la risposta infiammatoria, radicolite, vertebrali osteolisi corpo, e eiaculazione retrograda continuano ad essere questioni di interesse a causa degli importi utilizzati sovrafisiologici 4,5.
Pertanto, abbassando la dose di BMP-2 rimane una strategia rilevante in alletenta di ridurre al minimo gli effetti collaterali. Inoltre, i sistemi di trasporto efficienti sono tenuti a sopprimere il rilascio scoppio iniziale di BMP-2 osservata in sistemi di trasporto spugna di collagene contemporanea e rafforzare ulteriormente la consegna prolungata e localizzato di questo potente citochina. Il layer-by-layer autoassemblaggio di alternare polielettroliti cationici ed anionici può essere impiegato come metodo sintonizzabile per costruire complessi polielettroliti sulla superficie delle matrici impalcature o materiali impiantabili 6. A questo proposito, eparina (noto per avere la più alta densità di carica negativa di tutti gli agenti biologici) è stato riconosciuto di impegnare avidamente con una varietà di fattori di crescita tramite domini elettrostatiche ed eparina vincolanti. Infatti, eparina ha dimostrato di prolungare l'emivita e potenziarne la bioattività di diversi fattori di crescita così.
Sulla base di questo, il nostro gruppo adattato un protocollo di auto-assemblaggio layer-by-layer per fabbricare un complesso polielettrolita eparina-based (PEC) che carichi e conserva le bioattività dei fattori di crescita osteogeniche durante l'immobilizzazione 7,8. Il nucleo microbead alginato è stato fabbricato per reticolazione α-L-guluronate (G) residui di alginato con ioni bivalenti cationi di calcio e stronzio. Il nucleo alginato è una matrice scaffold biodegradabili; che dopo l'impianto, viene riassorbito nel letto fusion fornire spazio per crescita ossea. Poly-L-lisina (PLL) o protamina viene utilizzato come strato cationico di intrecciare sia con la matrice scaffold (in questo caso, il nucleo alginato carrier microbead) e l'eparina carica negativa; mentre le funzioni di livello eparina anionici per stabilizzare e localizzare fattori di crescita caricati. Il triplo strato PEC ha dimostrato di aumentare la capacità di carico del fattore di crescita in un modello suino 9. Recentemente, vettori PEC hanno dimostrato di ridurre con successo la dose efficace di BMP-2 di almeno 20 volte nel ratto 10 e modelli suina di fusione spinale 8.
S copi "> Qui, riportiamo i metodi di fabbricazione di PEC per una crescita maggiore consegna fattore di fusione spinale e gli altri interventi di chirurgia ricostruttiva delle ossa utilizzando BMP-2 come fattore di modello di crescita osteogenico.Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta un metodo per la preparazione dei PEC attraverso layer-by-layer autoassemblaggio. La struttura layer-by-layer viene visualizzato per mezzo analoghi fluorescenti di protamina, eparina, microscopia BMP-2 e Nell-1 e confocale. Assorbimento e rilascio prove dimostrano che l'eparina sulla PEC media osteogenica fattore di crescita l'assorbimento e il rilascio. L'efficienza di assorbimento del metodo PEC è: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Il vettore PEC ha una migliore modulaz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Referências
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